Расследование Teliospore прорастания с использованием Microrespiration анализа и Microdissection

Общая цель представленных здесь процедур состоит в том, чтобы определить стадии прорастания спор, чтобы можно было оценить уровни транскриптов генов. Анализ этих изменений позволит получить дополнительные знания о критической стадии распространения болезней. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о переходах во время прорастания телиоспор, которые связаны с изменениями в уровнях транскриптов генов и, таким образом, отражают сдвиги в контроле экспрессии генов.

Основные преимущества этой методики заключаются в том, что она выявляет переходы в уровне дыхания, которые не соответствуют видимым морфологическим переключателям, и позволяет физически изолировать телиоспоры на различных стадиях прорастания. Этот метод имеет значение для контроля распространения патогенов, поскольку он позволяет нам идентифицировать ключевые переходы в прорастании спор, которые, если их изменить, могут блокировать распространение болезни. Начните эту процедуру с заражения кукурузных початков, сбора телиоспор, а также проверки жизнеспособности телиоспор и прорастания, как описано в текстовом протоколе.

Чтобы вызвать прорастание, сначала взвесьте равное количество телиоспор для каждого эксперимента с дыханием. В шкафу биобезопасности добавьте телиоспоры в камеру автоклавного дыхания. Заполните камеру отваром картофельной декстрозы, дополненным сульфатом стрептомицина и сульфатом канамицина.

Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы создать телиоспоровую суспензию. Поместите крышку камеры в камеру, чтобы создать герметичное уплотнение. Чтобы получить измерение OCR, сначала поместите камеру в штатив камеры внутри водяной бани.

Затем поместите кислородный зонд внутрь отверстия камеры. Отслеживайте точки данных, появляющиеся в режиме реального времени в программе скорости трассировки датчика. Дайте щупу стабилизироваться в течение примерно трех минут после того, как зонд будет помещен в камеру.

Нажмите «Измерить», чтобы измерять уровень кислорода непрерывно в течение шести часов с интервалом в две секунды. Остановите измерение и повторите эти шаги для каждого анализируемого образца перед экспортом данных в Microsoft Excel и выполнением анализа данных, как описано в текстовом протоколе. Поместите примерно 10 миллиграммов телиоспор umatus в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Суспендируйте телиоспоры в 500 микролитрах PDB с добавлением стрептомицина сульфата. Аккуратно пипеткой перемешать до тех пор, пока в среде не останется комочков телиоспор. Перенесите телиоспоровую суспензию в автоклавированную колбу Эрлина Мейера объемом 250 миллилитров, содержащую PDB, дополненную сульфатом стрептомицина.

Инкубируйте колбу на ночь при температуре 28 градусов Цельсия, встряхивая при 90 об/мин. Приготовьте чашку Петри, нанеся четыре-пять пятилитровых капель дистиллированной воды на верхнюю часть чашки Петри. Затем пипеткой нанесите на чашку Петри три капли двухмикролитрового раствора для стабилизации РНК, которые будут использоваться для сбора образцов.

Также пипеткой нанесите 30 пятимикролитровых капель прорастающих телиоспор на чашку Петри. Добавьте в чашку Петри 15 миллилитров минерального масла. Прежде чем продолжить, убедитесь, что все капли покрыты маслом.

Далее подготовьте микрокапилляр с промежуточным диаметром 15 микрон, фланцем толщиной в один миллиметр, длиной 55 миллилитров и углом кончика 20 градусов. Поместите его в держатель микрокапилляров и погрузите в минеральное масло, где капиллярное действие позволит минеральному маслу проникнуть в микрокапилляры. Сбросьте давление в микрокапилляре перед тем, как подвести его к капле воды.

Аспират для приготовления микрокапилляров с водой. С помощью органов управления микроманипулятора переместите подготовленный микрокапилляр к одной из прорастающих капель, и проникните внутрь капли. Опустите микрокапилляр, и доведите устье микрокапилляра до прорастающей телиоспоры на интересующей стадии прорастания.

Медленно аспирируйте для того, чтобы захватить прорастающую телиоспору. Прекратите аспирацию, как только телиоспора попадет в микрокапилляр. Повторяйте до тех пор, пока в микрокапилляре не останется примерно пять телиоспор.

Поднимите микрокапилляр с помощью микроманипулятора и поднесите его к сбору капли раствора для стабилизации РНК. Проникните в каплю и введите телиоспоры в каплю. Повторяйте эти шаги до тех пор, пока не будет захвачено примерно 1000 телиоспор.

Чтобы извлечь каплю сбора, нанесите каплю сбора и перенесите ее на крышку свободной микроцентрообразующей пробирки ДНК РНК объемом 2,0 миллилитров. Осторожно нанесите минеральное масло с помощью пипетки, не нарушая сбор капли. Телиоспоры теперь могут быть использованы для последующих приложений, таких как выделение РНК.

Этот график иллюстрирует типичный результат оценки изменений уровня кислорода в суспензиях телиоспор, индуцированных для прорастания. По сравнению с неиндуцированными телиоспорами, разделение, указывающее на начало дыхания, происходит примерно через 30 минут. Учитывая, что на настройку и транспортировку образца к кислородному зонду уходит около 15 минут, то на самом деле это время составляет 45 минут.

Здесь показаны пять стадий прорастания телиоспор. На первой стадии телиоспоры индуцируются к прорастанию, но не проявляют морфологических признаков прорастания. Телиоспоры второй стадии показывают возникший промицелий длиной меньше диаметра телиоспоры.

На третьей стадии длина промицелия больше диаметра телиоспоры. Четвертая стадия характеризуется промицелием с прикрепленными базидиоспорами. А на пятой стадии появляются почковающиеся базидиоспоры.

Здесь показаны асинхронно прорастающие телиоспоры, а микрокапилляр расположен рядом с телиоспорой третьей стадии. Затем телиоспоры третьей стадии аспирируют в микрокапилляр и переносят в каплю раствора для сбора. После освоения этот метод микродиссекции может быть использован для выделения 1000 стадийных телиоспор за шесть-семь часов.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о частых перерывах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как физически изолировать споры на морфологически различных стадиях прорастания. И определите время начала дыхания.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности из-за необходимости поддержания стерильности. И необходимость терпения и выделения типов клеток с помощью микродиссекции. Разработка этого метода открывает путь для грибковых фитопатологов к изучению морфологических и молекулярных аспектов прорастания разрушительных головневых и ржавчинных грибов, которые угрожают глобальной продовольственной безопасности.

Хотя этот метод применим к нам, лигоматикам, он также может быть использован во многих других разрушительных сельскохозяйственных культурах, которые приводят к миллиардам долларов потерь ежегодно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как выделение РНК, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, каков профиль и время изменения уровня транскрипта?