Стволовых клеток кишечника изоляции и культуры в свинину модели сегментарный малого кишечника ишемии

Общей целью этой процедуры является оценка влияния ишемии кишечника на эпителиальные стволовые клетки кишечника. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии стволовых клеток, например, как стволовые клетки сопротивляются повреждениям и способствуют восстановлению после ишемического повреждения. Основное преимущество этой методики заключается в том, что это большая животная модель, которую можно использовать для изучения клинических заболеваний кишечника и их восстановления.

Демонстрировать процедуру будут Эми Стилер Стюарт, аспирант, и Джон Фройнд, специалист по исследованиям из моей лаборатории. Начните с использования лезвия скальпеля, чтобы сделать от восьми до 10 сантиметров вентрального разреза по средней линии на животе с центром в пупке помесной свиньи из Йоркшира от 8 до 10 недель. Расположите тощую кишку примерно в 40 сантиметрах от илеоцекального соединения.

Дважды переложите кишечник по окружности, чтобы очертить петли тощей кишки длиной 10 сантиметров с расстоянием в один сантиметр между каждой лигатурой. Создайте две петли для каждой временной точки ишемии рядом друг с другом, одну для ишемии и одну для ишемии с дополнительным одним часом реперфузии. Чтобы вызвать обратимую полную ишемию, используйте бульдожьи сосудистые зажимы или гемостатики для обструкции примерно трех брыжеечных сосудов на один зажим в течение соответствующего экспериментального периода времени.

Держите живот закрытым на протяжении всего ишемического периода. В конце эксперимента с помощью ножниц Метценбаума сначала соберите контрольный кусочек нормальной тощей кишки на расстоянии не менее 5-10 сантиметров проксимальнее последней ишемической петли, а затем соберите остальные петли. Храните петли с каждой точки времени травмы в небольших контейнерах с ледяным PBS до изоляции крипты.

Чтобы изолировать стволовые клетки крипты, используйте проволоку 20-го калибра и тканевые щипцы, чтобы перевернуть каждую петлю тонкой кишки так, чтобы поверхность слизистой оболочки была открыта. Надежно пришить верхнюю и нижнюю части каждой петли к проволоке и промыть каждую перевернутую петлю в ледяном PBS. Когда весь световой мусор будет удален, немедленно поместите образцы в отдельные 50 миллилитровые конические пробирки, содержащие 30 миллилитров диссоциационного реагента номер один, на лед на 30 минут с встряхиванием и инверсией каждые пять минут.

В конце инкубационного периода образцы переложить в соответствующие 50-миллилитровые пробирки, содержащие 30 миллилитров диссоциационного реагента номер два, и гранулировать двух-четырехчасовые образцы ишемической петли центрифугированием. Повторно суспендируйте гранулы в пяти миллилитрах PBS и используйте аликвоту в 50 микролитров из каждого образца, чтобы проверить степень ассоциации крипты и количество мусора с помощью световой микроскопии. Далее поместите образцы на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 10 минут с встряхиванием или инверсией каждые пять минут.

Затем перенесите образцы непосредственно в 25 миллилитров ледяного PBS на льду в орбитальном шейкере, настроенном на 60 оборотов в минуту, на две-пять минут встряхивания с дополнительным ручным встряхиванием или инверсией каждые 30 секунд. В конце инкубации встряхивания проверьте степень ассоциации крипты и количество мусора и переложите образцы в новые 50-миллилитровые конические пробирки, содержащие 25 миллилитров холодного PBS для встряхивания до тех пор, пока не будут выделены неповрежденные крипты с минимальным количеством мусора и ворсинок. Когда петли будут полностью диссоциированы, удалите оставшуюся ткань, гранулируйте образцы центрифугированием и снова суспендируйте оставшиеся гранулы крипты в пяти миллилитрах свежей PBS.

Затем 150 крипт из каждой пробирки в отдельные микроцентрифужные пробирки и гранулируют крипты с помощью микроцентрифугирования. С помощью предварительно охлажденной пипетки аккуратно суспендируйте гранулы с 50 микролитрами мастер-смеси на лунку с последующим быстрым пипетированием 15 раз для смешивания. Затем нанесите каплю крипты объемом 50 микролитров в центр каждой лунки предварительно червяченной и сетчатой 24-луночной пластины и поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия.

Через 30 минут посыпьте каждую матричную котлету 500 микролитрами на лунку среды кишечных эпителиальных стволовых клеток, добавив 500 микролитров стерильного PBS в любые неиспользуемые лунки для поддержания влажности и подсчета количества покрытых крипт нулевого дня. Добавляйте факторы роста в каждую лунку каждые 48 часов, заменяя надосадочную жидкость каждые 96 часов 500 микролитрами свежей среды, обогащенной фактором роста. Полная ишемия кишечника создается в петлях тонкой кишки путем использования окклюзии сосудов с помощью швов или зажимов, как показано.

При правильном выполнении ишемическое повреждение начнется на кончике кишечных ворсинок и мигрирует вниз внутри крипты по мере увеличения продолжительности ишемии. Одна из распространенных ошибок при хирургической технике может произойти, когда кровеносные сосуды не перевязаны или не пережаты равномерно, что приводит к геморрагической ишемии, при которой тонкостенная вена коллапсирует перед артерией, позволяя дополнительной крови проникать в ткани. После удаления ишемизированных петель кишечника кишечные крипты могут быть успешно изолированы в соответствии с протоколом диссоциации, как показано выше.

Склепы из более сильно поврежденных временных точек часто разрушены и содержат больше фонового клеточного мусора по сравнению с теми, которые не подвергаются или получают легкие повреждения. Когда нормальные и слабо поврежденные кишечные крипты покрываются в культуре, энтеросферы образуются в течение 24-48 часов. При сильном ишемическом повреждении кишечные крипты выживают, но повреждаются, что приводит к образованию гораздо меньших сфер на начальном этапе.

К 72-120 часам энтероиды из всех крипт становятся более сложными с очевидными центральными просветами и почковающимися структурами, а также с общим снижением эффективности роста крипты, а также уменьшением размера энтероидов, полученных из сильно поврежденной кишечной ткани. После освоения процедуры изолирующего покрытия крипты могут быть завершены примерно за два-три часа, если они выполнены правильно. Лучше всего, чтобы крипты, собранные для гальванического покрытия, были получены из смывок, а не из диссоциирующих фракций из-за повышенной вероятности загрязнения культуры во фракции диссоциации.

Этот метод также может быть использован для проверки эффективности препаратов для лечения повреждений эпителия, возникших в результате ишемии плюс или минус реперфузия. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии желудочно-кишечного тракта к изучению влияния ишемии на эпителий, в частности, на стволовые клетки кишечника на трансляционной, клинически значимой модели крупного животного происхождения. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как создать кишечную ишемию с реперфузией или без нее, а также изолировать кишечные крипты для 3D-культуры после повреждения in vivo.