Количественное определение морфологии микроглии от микрофотографиями иммуногистохимия подготовлен с использованием ImageJ ткани

Общая цель этих методов скелетного и фрактального анализа заключается в измерении морфологии микроглии из ткани, подготовленной ИГХ, с использованием количественных методов, которые являются как высокопроизводительными по своей природе, так и чувствительными для обнаружения небольших различий в формах клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейроинфаллелизма, определив нюансы формы и функции микроглии во время здоровья и болезни. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он количественно оценивает морфологию микроглии с помощью непрерывных, а не категориальных переменных.

Описанные здесь методы не требуют проприетарного программного обеспечения, и могут быть использованы для скрининга областей мозга или поклеточного анализа. Демонстрировать процедуру будет Кимберли Янг, техник из моей лаборатории. Прежде чем начать, убедитесь, что плагин AnalayzeSkeleton был загружен на ImageJ или Fiji.

Затем откройте стек Z размером 30 микрон, показывающий иммуноокрашенный мозг Iba1. Если вы используете флуоресцентную микрофотографию, убедитесь, что изображение имеет 8-битное значение, и преобразуйте его в оттенки серого, чтобы наилучшим образом визуализировать все положительные пятна. Используйте панель инструментов и нажмите «Изображение», «Таблицы поиска», «Серый».

Если вы используете фотографию яркого поля в формате DAB, сначала используйте плагин фильтра FFT Bandpass с настройками по умолчанию. Нажмите «Обработать», «БПФ», «Фильтр полосы», а затем преобразовать в оттенки серого. Если изображение слишком тусклое, чтобы визуализировать процесс микроглии, используйте панель инструментов и нажмите «Изображение», «Настройка», «Яркость/контрастность».

При необходимости отрегулируйте минимальное или максимальное количество ползунков до краев гистограммы, но не дальше. Регулировка яркости приводит к наибольшей вариативности при анализе данных и поэтому является наиболее важным этапом. Затем запустите фильтр «Контурная резкость» для дальнейшего увеличения контраста, нажав «Обработать», «Фильтры», «Контурная резкость».

Выполните шаг удаления пятнистых точек, чтобы удалить шум соли и перца, создаваемый маской Unsharp. Используйте панель инструментов и нажмите Обработать, Шум, Удалить пятна. Преобразуйте изображение в двоичное, выбрав «Изображение», «Настройка», «Порог».

Затем примените функцию удаления пятен к двоичному изображению, чтобы удалить оставшийся однопиксельный шум. Затем примените функцию «Закрыть», нажав «Обработать», «Двоичный», «Закрыть», чтобы соединить темные пиксели, разделенные максимум двумя пикселями. Затем удалите выбросы, нажав «Обработать», «Шум», «Удалить выбросы».

После сохранения изображения в виде отдельного файла для дальнейшего использования, скелетизируйте изображение с помощью панели инструментов, нажав «Обработать», «Двоичный», «Скелетизировать». Выберите скелетированное изображение и запустите подключаемый модуль AnalyzeSkeleton, щелкнув Плагины, Скелет, Анализ скелета и установив флажок в информационном поле ветви. Скопируйте данные из результатов и выходных данных о ветвях и вставьте данные в таблицу Excel.

В Excel обрежьте данные, чтобы удалить фрагменты скелета, полученные в результате ИГХ и получения изображений. Определите, какая длина фрагментов будет обрезана из набора данных, открыв скелетированное изображение в ImageJ и выбрав инструмент Линия. Измерьте несколько фрагментов, обращая внимание на среднюю длину, и определите пороговое значение, которое должно быть одинаковым для всего набора данных.

Настройте пользовательскую сортировку таблицы Excel, нажав кнопку «Сортировка и фильтр», «Пользовательская сортировка». Сортировка по вокселям конечных точек от наибольшего к меньшему, а на новом уровне — по ветви Mx PT от наибольшего к меньшему. Удалите все строки, содержащие две конечные точки с максимальной длиной ветви меньше порогового значения.

Суммируйте данные в столбце конечных точек, чтобы вычислить общее количество конечных точек, собранных из изображения. Повторите эти действия для информационных данных ветвей после сортировки по длине ветви. После того, как все данные были обрезаны и суммированы, разделите данные с каждого изображения на количество сомов микроглии на соответствующем изображении.

Введите конечную точку и длину ячейки и ветви для каждой ячейки в статистическое программное обеспечение. Убедитесь, что плагин FracLac загружен. Затем используйте инструмент прямоугольника, чтобы нарисовать ROI.

Убедитесь, что рамка достаточно велика для захвата всей ячейки и может оставаться неизменной во всем наборе данных. В окне «Диспетчер ROI» выберите «Обновить», чтобы зафиксировать ROI на случайно выбранной ячейке на микрофотографии. Откройте двоичное изображение, содержащее выбранную ячейку.

Дважды кликните по инструменту «Кисть», установите цвет на черный и отрегулируйте ширину кисти по мере необходимости. Используя соответствующую микрофотографию в качестве образца, используйте кисть для удаления смежных клеточных процессов, соединения фрагментированных процессов и изоляции интересующей клетки. После того, как двоичная ячейка будет изолирована, сохраните двоичный файл.

Преобразуйте двоичную ячейку в контур с помощью панели инструментов, через Процесс, Двоичный файл, Контур. На панели инструментов откройте FracLac с помощью панели инструментов, нажав «Плагины», «Фрактальный анализ», «FracLac», и выберите BC для подсчета коробок. В окне "Проектирование сетки" задайте для параметра Num G значение четыре.

В разделе «Параметры графики» установите флажок «Метрики», чтобы проанализировать выпуклую оболочку и ограничивающую окружность ячейки. По завершении нажмите кнопку «ОК», а затем нажмите кнопку «Сканировать», чтобы запустить сканирование подсчета коробок на выбранном изображении. В окне "Результаты корпуса и круга" скопируйте все требуемые результаты данных.

Затем проделайте то же самое в окне Box Count Summary. Перенесите скопированные данные в файл Excel или статистическое программное обеспечение. На этом графике представлены сводные данные о конечных точках микроглии на клетку и длине обработки на клетку в неповрежденной и поврежденной корковой ткани.

Это результат анализа с применением протокола. В обоих случаях был проведен статистический анализ с использованием T Test, а также проанализированы три изображения. Необходимо проявлять осторожность в отношении вариативности между пользователями при применении протокола.

Такие различия обобщены здесь, где один и тот же набор данных был проанализирован двумя независимыми пользователями с применением идентичного протокола. Несмотря на схожие тенденции на всех участках, вариативность между пользователями влияет на значимость данных. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что цель состоит в том, чтобы получить скелет или контурную модель, которая является репрезентативной для оригинальной микрофотографии.

Это означает, что шаги могут быть изменены в соответствии с конкретными потребностями исследователя. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как быстро количественно оценить морфологию микроглии по микрофотографиям иммуногистохимических тканей с помощью легкодоступного компьютерного программного обеспечения.