Характеризуя процессов репарации ДНК в переходных и Long-lasting двухнитевые разрывы ДНК по микроскопии иммунофлуоресценции

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репарации ДНК, такие как регулирование формирования, локализации и разрешения комплекса репарации ДНК. Главное преимущество этой методики в том, что она позволяет однозначно обнаруживать изменения и исправлять сложную локализацию и кинетику. В дополнение к этим исследователям в моей лаборатории эксперименты будут проводить три аспиранта.

Это будут Чанкун Ху, Далтон Дакус и Стивен Уолтерхаус. Для начала выращивайте клетки U2OS/DR-GFP на 10-сантиметровом планшете для культуры тканей до тех пор, пока они не станут слитыми на 85-90%. Затем удалите среду, добавьте три миллилитра ЭДТА, и инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение трех минут.

Замените ЭДТА одним миллилитром трипсина и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем добавьте пять миллилитров DMEM, чтобы нейтрализовать трипсин. После подсчета ячеек засейте шесть раз по 10 до трети клеток в лунку по 200 мкл среды в стеклянном дне 96-луночного планшета.

В качестве альтернативы высевайте четыре раза по 10-шесть лунок в восемь миллилитров среды на 12-миллиметровой покровной пластине, помещенной в 10-сантиметровую пластину, затем выращивайте ячейки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Чтобы вызвать двухцепочечные разрывы, замените среду перекисью водорода, разведенной до концентрации 25 микромоляров с DMEM плюс 10% FBS, и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Промойте клетки три раза 1x PBS, затем добавьте свежий DMEM.

Чтобы зафиксировать клетки после их инкубации, используйте PBS для трехкратной промывки тарелки. Затем с помощью иглы и щипцов осторожно снимите покровную пластину с 10-сантиметровой пластины для каждой временной точки и поместите ее в одну лунку 24-луночной пластины. Добавьте 4% PFA и инкубируйте клетки в течение 15 минут.

Затем мы ПБС отстираем чехол листком три раза. Чтобы проникнуть в клетки, добавьте 0,5% неионогенного детергента и PBS. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 15 минут.

Затем еще раз промойте камеры PBS три раза. Затем добавьте 3% БСА и 0,1% неионогенного моющего средства, разведенного в PBS, в покровные стекла в 24-луночный планшет и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение одного часа. Затем добавьте первичные антитела, нацеленные на интересующий белок репарации, и инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение одного часа.

Промыв клетки PBS три раза, добавьте DAPI и инкубируйте планшеты при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем инкубируйте образцы со вторичными антителами. После промывки ячеек, как и раньше, с помощью монтажного реагента закрепите защитную ячейку скользящей стороной вниз на предметных стеклах.

Осторожно надавите на защитные стекла и с помощью салфетки впитайте излишки монтажного реагента. Заклейте покровные стекла быстросохнущим прозрачным лаком для ногтей и обеспечьте полное прилегание покровного стекла с помощью задвижки. Делайте снимки с помощью конфокального микроскопа, фокусируясь на канале DAPI.

Чтобы определить ядра в иммунофлуоресцентных изображениях, откройте конфокальные изображения, перетащив файл изображения в окно ImageJ или выбрав импортер биоформатов на панели инструментов плагина в ImageJ. Затем выберите разделенные каналы. В разделе «Параметры цвета» выберите «Расцвеченный» в выпадающем меню.

Нажмите OK, чтобы открыть образы DAPI и гистона H2AX в виде отдельных окон, и выберите образ DAPI. Затем выберите панель инструментов изображения в опции настройки порога, чтобы выбрать ядра. Затем настройте порог изображения, сдвинув нижнюю панель окна порога полностью вправо.

Отрегулируйте верхнюю полосу до тех пор, пока ядра не станут полностью красными с четкими контурами, а фон станет черным. Затем выберите панель инструментов анализа и параметр анализа частиц. Введите минимальный размер ядра.

В раскрывающемся меню «Показать» выберите контуры, затем выберите опцию «Добавить в менеджер». Нажмите OK, чтобы открыть окно менеджера ROI. В окне менеджера ROI присвойте нумерация ядрам по выборке.

Чтобы использовать ImageJ для количественного определения очагов H2AX и изображений иммунофлуоресцентной микроскопии, выберите окно очагов H2AX. Затем выберите панель инструментов процесса и выберите Найти максимумы, чтобы найти очаги внутри ядер. В выпадающем меню типа вывода выберите опцию одиночных точек и выберите выбор точки предварительного просмотра, чтобы визуализировать фокусы максимумов.

Затем введите значение допуска к шуму в зависимости от интенсивности цветения изображения. В окне менеджера ROI выберите ядра, для которых необходимо количественно определить очаги H2AX. Выберите меру, чтобы измерить количество фокусов максимумов в выбранных ядрах.

Скопируйте исходные значения интенсивности и вставьте их в программное обеспечение для анализа данных. После посадки клеток на 96-луночные планшеты с покровными листами, как было показано ранее в этом видео, индуцируйте двухцепочечные разрывы с помощью трансфекционного агента на основе липидов для трансфекции клеток с вектором экспрессии I-SceI. Чтобы получить представление о том, что после промывки vix проникают и блокируются клетки, как показано ранее, добавляют антитела против гамма H2AX и репарируют интересующий белок.

С 1x PBS промывка 96-луночной пластины скользит три раза. Затем инкубируют 96-луночный планшет с покрытием листков со вторичными антителами. Наконец, после идентификации клеток, которые имеют большой ядерный гамма-фокус H2AX, вручную подсчитайте те, которые также демонстрируют колокализацию с интересующим белком репарации.

На этом рисунке показана дискриминация шума 90 и обозначено правильное количество очагов. Ядра на краю и очаги за пределами ядер не учитываются при количественном определении. Показанная здесь панель имеет низкий уровень шума 50.

Многочисленные максимумы выявляются вне ядра и внутри него. В этой ячейке обнаружена высокая устойчивость к шуму 220. Обнаружен только единичный очаг

На этом рисунке изображена колокализация гамма-фокуса H2AX и представляющего интерес белка репарации. Здесь показана нетрансфицированная клетка, а в правом верхнем углу — клетка с неядерным гамма-фокусом H2AX. При большем увеличении можно различить более четкую картину истинного внутреннего фокуса и неядерного или внешнего фокуса.

Наконец, здесь показан пример ядерного гамма-фокуса H2AX без колокализации белка репарации. После освоения этой техники ее можно сделать за несколько дней, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как осаждение комутора, чтобы идентифицировать взаимодействия между белками репарации, представляющими интерес.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как наблюдать за формированием и разрешением комплексов репарации ДНК путем индуцирования переходных двухцепочечных разрывов в ДНК. Вы также узнаете, как однозначно отличить неправильную локализацию факторов репарации от запоздалого рекрутмента, вызывая долговременные поражения.