Метод подготовки эффективного образца для повышения углеводов Ион сигналов в Matrix с помощью лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрии

Была разработана простая процедура пробоподготовки для усовершенствования традиционного метода в матричной лазерной десорбционной ионизационной масс-спектрометрии путем реформирования простой морфологии в процессе сушки. Преимущество этого метода заключается в том, что интенсивность сигнала образцов углеводов, приготовленных этим оптимизированным методом, может быть эффективно увеличена. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что этап сброса давления метанола очень важен, и его необходимо выполнить за один раз.

Любые колебания приведут к снижению качества данных. Для начала, надев нитриловые перчатки, используйте 100 миллилитров раствора моющего средства для ручной мытья планшета с образцом. Используйте дистиллированно-деионизированную воду, или DD, для ручной мытья тарелки.

Затем с 30 миллилитрами метанола промойте его поверхность. Вставьте пластину с образцом в стакан объемом 600 миллилитров и заполните его водой DD до полного погружения пластины. Затем поместите стакан в ультразвуковую ванну и обработайте пластину ультразвуком в течение 15 минут.

Снимите пластину с образцом из стакана и используйте сжатый азот, чтобы сдуть капли воды. Затем нанесите 0,2 микролитра метанола на планшет с образцом, чтобы проверить, распространяется ли он на другие места. Если это так, повторите промывку, обработку ультразвуком и азотом, как показано выше.

После подготовки сушильной камеры согласно текстовому протоколу предварительно смешайте в микроцентрифужной пробирке 0,25 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты и 0,25 мкл раствора Сиалила-Льюиса А, или мальтогептаоза. Затем закрутите трубку на три секунды. Уменьшите перемешанный раствор в мини-центрифуге при 2000 умноженных на G в течение двух секунд.

Затем немедленно пипеткой нанесите 0,1 микролитра предварительно смешанного раствора на планшет с образцом. Когда образец высохнет, работая быстро, чтобы избежать испарения, нанесите пипеткой 0,2 микролитра метанола непосредственно на место с образцом. Образец снова растворится, а затем сразу же высохнет.

Этап осаждения метанола является самым сложным этапом, определяющим качество и воспроизводимость данных. Чтобы обеспечить наилучшую производительность, мы рекомендуем пользователю завершить осаждение за три-пять секунд, чтобы избежать значительных потерь метанола на испарение. Наденьте нитриловые перчатки и осторожно выньте планшет с образцом из сушильной камеры.

Затем под микроскопом исследуйте образец. Если морфология кристаллов не соответствует ожидаемой, повторите смешивание образца и нанесение пятен на планшет с образцом. Чтобы убедиться, что кристаллы образца имеют оптимальную морфологию после рекристаллизации, всегда используйте микроскоп для их осмотра.

Невооруженным глазом трудно правильно определить качество морфологии кристаллов. Для анализа образца объемом в один микролитр предварительно смешайте в микроцентрифужной пробирке 2,5 микролитра 2,5-раствора дигидроксибензойной кислоты и 2,5 микролитра раствора Сиалила-Льюиса А или мальтогептаозы. Вортексируйте предварительно смешанный раствор в течение пяти секунд.

Уменьшите перемешанный раствор в 2000 раз G в течение двух секунд, затем немедленно нанесите один микролитр предварительно смешанного раствора на планшет с образцом. После того как образец высохнет, нанесите пипеткой 1,5 микролитра метанола непосредственно на высушенное место с образцом. Образец повторно растворится и сразу же высохнет.

Осторожно извлеките образец из сушильной камеры. Рассмотрите образец под микроскопом. Если морфология кристаллов не соответствует ожидаемой, повторите приготовление раствора, как показано на рисунке.

Чтобы провести масс-спектрометрию, откройте управляющее программное обеспечение масс-спектрометра и вставьте пластину с образцом в машину. Выберите предварительно оптимизированный метод сбора данных в программном обеспечении, а затем с помощью программного обеспечения для визуализации зарегистрируйте всю область образца для масс-спектрометрии. Запуск сбора данных в пакетном режиме управляющего программного обеспечения.

Когда сбор данных будет завершен, используйте программное обеспечение для создания изображений для построения ионных изображений и анализа данных в соответствии с текстовым протоколом. Здесь представлены репрезентативные СЭМ-изображения сиалила-Льюиса А, смешанного с 2,5-дигидроксибензойной кислотой, полученной с использованием методов высушенной капли и рекристаллизации. Типичная морфология 2,5-дигидроксибензойной кислоты представляет собой крупные игольчатые кристаллы на краю и мелкие кристаллические структуры в центре образцовых пятен.

После рекристаллизации метанолом образец имеет большую площадь, равномерно покрытую мелкими, хлопьевидными кристаллами. На этом рисунке представлены результаты масс-спектрометрии Сиалила-Льюиса А и мальтогептаозы с рекристаллизацией метанола и без нее. После рекристаллизации распределение сигналов Сиалил-Льюиса А и мальтогепаозы хорошо согласуется с изображениями образцов в ярком поле.

Интенсивность сигнала в образцах рекристаллизованных углеводов также повышена по сравнению с обычными образцами сухих капель. На этом графике сравнивается интенсивность сигнала содированных или положительных ионных мод и депротонированных или отрицательных ионных мод углеводов рекристаллизованных образцов по отношению к таковой образцов с высушенными каплями. В среднем, рекристаллизация образцов сиалила-Льюиса А и мальтохептаозы увеличивала содированные сигналы в 3,9 и 3,3 раза.

Депротонированные ионные сигналы сиалила-Льюиса были усилены в 4,7 раза после рекристаллизации. После освоения образцы могут быть подготовлены за 10 минут с помощью этой техники, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно, чтобы капля метанола была немедленно и точно нанесена на место образца.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как эффективно управлять кристаллической морфологией нескольких образцов для получения наилучших ионных сигналов для рутинного анализа.