Идентификация Циклин зависимая киназа 1 сайты конкретных фосфорилирование киназы в Vitro пробирного

Общей целью данного анализа киназы in vitro является идентификация сайтов фосфорилирования в белке, представляющем интерес, которые специфичны для киназной циклин-зависимой киназы 1. Идентификация специфичных для CDK1 сайтов фосфорилирования важна, поскольку они дают механистическое представление о том, как CDK1 контролирует клеточный цикл. Регуляция клеточного цикла имеет решающее значение для фазовой сегрегации полных хромосом, а дефекты приводят к хромосомным аберрациям и раку.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она опирается на очищенные белки, поэтому может быть применена к любому модельному организму и дает надежные результаты, особенно в сочетании с функциональными исследованиями на клетках. Этот метод важен, поскольку известное количество мишеней CDK1 все еще невелико, несмотря на то, что CDK1 фосфорилирует от 8 до 13% протея. Хотя этот метод идентифицирует специфичные для CDK1 сайты фосфорилирования, он может быть модифицирован для идентификации сайтов фосфорилирования для других киназ при условии наличия очищенной киназы.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что условия для киназного анализа должны быть оптимизированы для каждой белковой мишени для получения высокой эффективности фосфорилирования. Предпочтительно 100%Используйте программное обеспечение IGPS 3.0 и посетите веб-сервер для прогнозирования специфичных для CDK1 сайтов фосфорилирования в последовательности белка-мишени CENP-F. Проверьте сайты фосфорилирования на соответствие консенсусной последовательности CDK1.

Начните сцеживание белка с подготовки предварительной культуры. Следуя инструкциям производителя, преобразуйте один микролитр экспрессионной плазмиды в 50 микролитров компетентных клеток E.coli. После добавления плазмиды инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут.

Затем инкубируйте клетки в течение 45 секунд при температуре 42 градуса Цельсия. После инкубации поместите клетки на лед на одну минуту, затем добавьте в клетки 400 микролитров LB, затем инкубируйте культуру в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая. Затем нанесите 200 микролитров культуры на агаровые планшеты LB, дополненные антибиотиками, представляющими интерес, в зависимости от конструкции.

Затем инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12-20 часов без встряхивания. Затем выберите колонию из агаровой пластины LB и инокулируйте колонию в 50 миллилитров среды LB с добавлением желаемой комбинации антибиотиков. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью от 160 до 180 оборотов в минуту в течение 12–20 часов.

На каждый литр ЛБ среды добавляют антибиотики и 10 миллилитров 40%-ного веса по объему стерильного фильтрованного раствора глюкозы. К этой среде добавляют 20 миллилитров плотно выращенной предкультуры. Затем инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая со скоростью от 160 до 180 оборотов в минуту.

Регулярно проверяйте впитываемость культуры на уровне 600 нанометров. Как только абсорбция достигнет 0,5-0,6, индуцируйте экспрессию белка путем добавления 0,2 миллимолярного IPTG. Затем инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов, встряхивая.

Через три часа соберите клетки центрифугированием при 4,100 G в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия с помощью поворотного ротора. После центрифугирования изгнать надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 20 миллилитрах связывающего буфера GST для CENP-F и его шести связывающих буферов для кариоферина альфа на каждый литр культуры.

Затем храните клетки при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы очистить CENP-F, сначала разморозьте клетки с помощью конструкции CENP-F. Затем отрегулируйте объем до 20 миллилитров с помощью буфера привязки GST.

После того, как объем отрегулирован, добавьте все восстановители и ингибиторы протеазы один за другим, чтобы подготовить клеточную суспензию к последующему лизису. Далее переложите клеточную суспензию в стеклянный стакан и погрузите стакан в ледяную водяную баню. Затем произведите посев ультразвуком.

После ультразвуковой обработки добавьте в лизат 250 микромолярных PMSF, после чего осмотрите лизат, который на этом этапе должен быть прозрачным. Затем центрифугируйте лизат при температуре от 12 000 до 40 000 раз G в течение 25 минут при четырех градусах Цельсия. Далее подготовьте колонку, добавив два миллилитра глутатиона агарозы один к одному в одноразовую хроматографическую колонку.

Чтобы сбалансировать колонку, сначала промойте ее 25 миллилитрами ультрачистой воды, а затем 25 миллилитрами связывающего буфера GST. После завершения центрифугирования сцедите надосадочную жидкость, а затем отфильтруйте надосадочную жидкость через заливку размером 0,2 микрометра. Далее вылейте лизат на закупоренную колонку для этапа связывания.

Закройте колонку крышкой и выдерживайте ее при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут, осторожно втирая и не допуская пенообразования. Через 30 минут переложите колонку на решетку и дайте смоле отстояться. Затем соберите поток и дважды промойте колонку 25 миллилитрами связующего буфера GST.

Как только промывка будет завершена, снова закупорьте колонку. Затем добавьте в колонку 400 микролитров связывающего буфера GST и 250 микролитров протеазы PS с активностью 1000 единиц на миллиграм. Снова закройте колонну крышкой и осторожно покрутите колонну, чтобы восстановить суспендию смолы в буфере, затем инкубируйте колонну при температуре четыре градуса Цельсия в течение 16-20 часов.

По окончании инкубационного периода добавьте четыре миллилитра буфера, связывающего GST, чтобы вымыть фрагмент CENP-F из колонки, которая была протеолитически расщеплена. Далее для выравнивания метки GST снова заглушите колонку. Затем добавьте в колонку четыре миллилитра элюирующего буфера GST, содержащего глутатион.

Затем инкубируйте колонку в течение 10 минут, чтобы вымыть связанную метку GST. Через 10 минут соберите элюат. Затем проводят электрофорез в полиакриламидном геле SDS для анализа фракций протеазы PS и элюирования глутатиона.

Затем, чтобы сконцентрировать образец белка, пипеткой отдайте протеазу PS в верхний отсек центробежного фильтрующего блока с отсечкой молекулярной массы в три килодальтоны. Затем центрифугируйте элюат при 4,100 G с шагом от 10 до 15 минут при четырех градусах Цельсия в поворотном роторе, чтобы сконцентрировать образец. После каждого приращения перемешивайте образец белка в концентрационном фильтре, осторожно пипетируя вверх и вниз, чтобы избежать образования градиента концентрации.

Чтобы очистить CENP-F с помощью гелевой фильтрации, присоедините колонку для фильтрации геля к системе быстрой жидкостной хроматографии белка. Далее уравновесьте колонну одним объемом гелевого фильтрационного буфера. Затем центрифугируйте фрагмент CENP-F в микроцентрифужной пробирке при 21, 700 умноженных на G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.

После окончания центрифугирования ввести образец в колонку, затем вымыть колонку с помощью фильтрационного буфера гелем и собрать 0,6 миллилитровые фракции фрагмента CENP-F. Далее анализируем профиль фильтрации геля и запускаем SDS-PAGE пиковых фракций. Пуловые фракции, содержащие чистый CENP-F.

Затем сконцентрируйте очищенный фрагмент CENP-F до 3,3 миллиграмм на миллилитр. Для определения концентрации белка разбавляют фрагмент CENP-F в соотношении один к 100 ультрачистой водой. Далее запишите спектр от 220 до 300 нанометров длины волны в спекрофотометр.

Далее приготовьте аликвоты 50 микролитров очищенного CENP-F в микропробирках объемом 0,5 миллилитров, затем мгновенно заморозьте пробирки в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Для киназного анализа смешайте фрагмент CENP-F с АТФ и циклином CDK1 B вместе с другими буферами в микропробирке объемом 0,5 миллилитров. Затем готовят второй образец без циклина В CDK1 в качестве отрицательного контроля.

Затем инкубируйте образцы на водяной бане при температуре 30 градусов Цельсия в течение от одного до 16 часов. Для успешной идентификации сайтов фосфорилирования с помощью масс-спектрометрии критически важно, чтобы эффективность фосфорилирования была как можно выше, предпочтительно 100%. Для повышения эффективности фосфорилирования добавьте больше киназы и увеличьте время инкубации до 16 часов. Затем добавьте равные объемы шестимолярного раствора гуанидина гидрохлорида к оставшейся киназной реакции и отрицательному контролю и проведите масс-спектрометрию для выявления сайта фосфорилирования.

Для получения высококачественных данных масс-спектрометрии также важно, чтобы очищенный образец белка был высокочистым и однородным. Сначала был проведен анализ SDS-PAGE, который показал явное смещение полосы вверх на геле для фосфорилированного CENP-F по сравнению с отрицательным контролем без CDK1, что указывает на то, что cNLS CENP-F является субстратом CDK1. Далее проводится масс-спектрометрия для анализа количества и эффективности сайтов фосфорилирования CENP-F.

Масс-спектр ионной ловушки ESI интактного in vitro фосфорилированного CENP-F показывает, что существует пять пиков, указывающих на четыре сайта фосфорилирования, и пятый пик является нефосфорилированным белком. Далее этот профиль элюирования исключения размера показывает, что объем элюирования пика кариоферина альфа смещается в сторону большей массы при добавлении дикого типа CENP-F, чего не наблюдается при добавлении мутанта CENP-F. Это указывает на то, что фосфомиметическая версия S3048D CENP-F действительно ослабляет взаимодействие CENP-F cNLS с кариоферином альфа.

Наконец, проведенный анализ SDS-PAGE показывает, что фрагмент CENP-F дикого типа с интактным cNLS колютируется с кариоферином альфа, что указывает на сильное взаимодействие. Тем не менее, мутант CENP-F и кариоферин альфа S3048D элюируют в отдельных пиках. При проведении этой процедуры важно помнить о проверке полученных сайтов фосфорилирования на соответствие последовательности консенсусного фосфорилирования CDK1 и убедиться, что идентифицированный субстрат локализуется в том же клеточном компартменте, что и CDK1.

После этой процедуры следует провести функциональную верификацию в клетках или животных моделях, чтобы подтвердить, что идентифицированные сайты фосфорилирования выполняют физиологическую функцию. Для функциональной верификации доступен ряд инструментов, таких как специфические ингибиторы CDK1 и фосфомиметические мутации. Из-за большого количества субстратов CDK1 в протеуме многие субстраты CDK1 человека еще предстоит открыть, и анализ киназы in vitro станет важным инструментом для идентификации, картирования и верификации этих участков.

Идентификация этих сайтов фосфорилирования позволяет проводить механистические исследования того, как CDK1 контролирует клеточный цикл. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как идентифицировать специфические сайты фосфорилирования CDK1 и целевые белки с помощью анализа киназы in vitro.