Изоляции человека эндометрия стромальных клеток In Vitro Decidualization

Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в области репродуктивной медицины о лежащих в основе молекулярных механизмах децидуализации и понимании роли конкретных генов в децидуализации стромальных клеток эндометрия. В этом исследовании представлен подробный протокол выделения стромальных клеток эндометрия человека и последующей искусственной децидуализации путем добавления гормонов в питательные среды. Экспрессия гормональных изменений, таких как пролактин и инсулиноподобный фактор роста, может быть использована для подтверждения и количественной оценки степени децидуализации.

Важно отметить, что также продемонстрирована жизнеспособность этого протокола для проведения геноспецифического нокдауна. Перенесите биопсию с помощью стерилизованных щипцов в 50-миллилитровую пробирку, содержащую десять миллилитров свежего HBSF, с последующим центрифугированием при 500x G в течение 90 секунд. С помощью пипетки объемом один мл удалите среду и добавьте три мл предварительно нагретой изолирующей среды hES.

Сцедите биопсию в 10-сантиметровую чашку, содержащую пять мл изолирующей среды hES, и начните измельчение с помощью щипцов Dumont 5 и тонких ножниц прямого стежка в течение примерно 20 минут. С помощью одной дозатора мл перенесите измельченную биопсию в новую пробирку объемом 50 мл и добавьте еще семь мл изоляционной среды hES в чашку, чтобы перенести оставшиеся кусочки в пробирку объемом 50 мл. Затем центрифугируйте образец в течение двух минут при 800x G и удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом один мл.

Затем отфильтруйте смесь для расщепления ДНКазы-1 и коллагеназы через фильтр 0,2 микрона, прикрепленный к 10-миллилитровому шприцу, непосредственно на гранулу. Затем закрутите трубку на 10 секунд, чтобы повторно суспендировать гранулу, и выдержите в течение 90 минут на водяной бане. Через каждые 10 минут поворачивайте трубку в течение 10 секунд, чтобы убедиться, что ткань правильно переваривается.

После инкубации отфильтруйте суспензию через клеточное сетчатое фильтр 40 микрон, уложенное на новую 50-миллилитровую пробирку, чтобы восстановить стромальные клетки, затем центрифугируйте собранные клетки при 800x G в течение 2,5 минут. После центрифугирования аккуратно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом в один миллилитр, следя за тем, чтобы не повредить клеточную гранулу. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах свежей среды для выделения hES с последующим центрифугированием при 800x G в течение 2,5 минут.

После центрифугирования осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в шести миллилитрах свежей среды hES. Затем, чтобы удалить клетки крови, медленно нанесите слой ресуспендированных клеток на три миллилитра градиентной среды и центрифугируйте образец при 400x G в течение 30 минут. После центрифугирования соберите надосадочную жидкость, не нарушая градиент плотности.

Затем добавьте среду hES, чтобы общий объем составил до 10 миллилитров, и снова центрифугируйте образец при 800x G в течение 2,5 минут. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в шести миллилитрах среды hES. Затем поместите клетки в 75-сантиметровую колбу, добавив в колбу шесть миллилитров ресуспензии клеток и 10 миллилитров среды hES, после чего аккуратно перемешайте путем покачивания колбы.

После нанесения покрытия проверьте плотность клеток под микроскопом, затем культивируйте клетки в инкубаторе с 5% углекислым газом в течение трех-пяти дней, обязательно меняя среду hES каждые два дня. Через 48 часов клетки должны разрастись как монослой. Как правило, через пять дней клетки достигают от 80 до 90% конфлюенции в 75-сантиметровой колбе.

Для трансфекции миРНК начните с помещения 800 000 клеток в лунку в шестилуночный планшет в трех экземплярах для каждого условия и инкубируйте клетки в инкубаторе с 5% углекислым газом в течение двух дней для подготовки к трансфекции. Через два дня добавьте 150 микролитров сыворотки Opti-MEM в пробирку объемом пять мл, после чего добавьте пять микролитров реагента для трансфекции. Хорошо перемешайте путем инверсии, и выдержите в течение пяти минут.

Затем добавьте 100 микролитров сыворотки Opti-MEM в новую пробирку объемом пять мл с последующим добавлением 16 наномолей миРНК SRC-2. Затем добавьте 100 микролитров свободной сыворотки Opti-MEM в пробирку объемом пять мл с последующим добавлением 16 наномолей контрольной миРНК. После инкубации соедините разведенный реагент для трансфекции с миРНК SRC-2 и хорошо перемешайте пипетированием вперед и назад.

Затем соедините разведенный реагент для трансфекции с контрольной миРНК и хорошо перемешайте, пипетируя вперед и назад. Затем инкубируйте комплексы в течение пяти минут. Во время этой инкубации отсасывайте среду hES и добавьте по одному миллилитру среды для замены в каждую лунку.

После пяти минут инкубации центрифугируйте комплексы при 500х G в течение двух минут для сбора раствора. Затем добавьте 250 микролитров комплексов реагентов для трансфекции миРНК в каждую лунку, содержащую клетки и среды, и перемешайте путем осторожного покачивания, после чего следует инкубация в инкубаторе с 5% углекислым газом в течение пяти часов при температуре 37 градусов Цельсия. Через пять часов аспирируйте среду и перейдите на среду hES, а затем продолжайте инкубацию в течение двух дней, готовясь к анализу децидуализации in vitro.

После 48-часовой трансфекции и до начала анализа децидуализации in vitro соберите контрольные клетки, трансфицированные миРНК и миРНК SRC-2. Сначала отсадите среду и промойте одним мл PBS на лунку. Затем удалите PBS, добавьте 300 микролитров буфера для лизиса РНК в лунку и инкубируйте в течение трех минут.

После трех минут инкубации соберите клетки в буфере для лизиса РНК в пробирку объемом 1,5 мл для последующего анализа. Затем приготовьте среду ЭПС, выделив соответствующий объем децидуализационной среды, и добавьте 10 наномолярных эстрадиолов, один микромоляр медроксипрогестерона ацетат и 50 микромолярных циклических аденозинмонофосфатов в 50 миллилитровую пробирку. В оставшиеся шесть лунок добавьте по два миллилитра среды EPC в каждую лунку и инкубируйте клетки в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести дней, меняя среду EPC каждые 48 часов.

После шестого дня соберите контрольные гранулы миРНК шестого дня и гранулы миРНК SRC-2, трансфицированные на шестой день в буфер для лизиса РНК для последующего анализа с помощью ПЦР в реальном времени. Индукция децидуализации эстрогеном медроксипрогестерона ацетатом и циклическим аденозинмонофосфатом приводит к цитоскелетной перестройке стромальных клеток из удлиненных фибробластических клеток в округлые эпителиодные клетки. Окрашивание фаллоидином стромальных клеток эндометрия также выявляет реорганизацию цитоскелета активных волокон, характерную для децидуализации hES.

В клетках, обработанных носителем, клетки остаются фибробластическими по внешнему виду, в то время как в клетках, обработанных ЭПК, чЭС выглядит эпителиоидным. Для подтверждения эффективности анализа децидуализации in vitro в течение 6-дневного периода оценивали уровни транскриптов мРНК маркеров децидуализации пролактина и белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста-1. При децидуализации стромальных клеток эндометрия человека уровни пролактина и IGFBP1 увеличивались в зависимости от времени.

Зависящее от времени повышение уровня секретируемого пролактина также было подтверждено при исследовании питательных сред тканевых культур hES методом ИФА. Геноспецифические нокдаун-эффекты на клеточные и молекулярные изменения децидуализации стромальных клеток эндометрия человека оценивали на шестой день культивирования после 48-часовой трансфекции миРНК с контролем или коактиватором стероидных рецепторов 2 миРНК. Контрольные миРНК-трансфицированные hES продемонстрировали клеточные и молекулярные изменения, согласующиеся с надлежащей децидуализацией, включая морфологическое изменение булыжника и повышение уровня транскриптов маркеров децидуализации PRL и IGFBP1.

При нокдауне миРНК SRC-2 hES оставался фибробластическим по внешнему виду по сравнению с контрольной миРНК, трансфицированной hES, и показал значительно сниженные уровни транскриптов PRL и IGFBP1. Уровни транскриптов SRC-2 были значительно снижены в трансфицированных миРНК SRC-2 hES по сравнению с контрольной миРНК, что указывает на жизнеспособность этого метода для сайленсинга генов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить первичные стромальные клетки из биопсии эндометрия с целью децидуализации in vitro и нокдауна конкретного интересующего гена с помощью трансфекции миРНК.