Обогащение и характеристика опухоли иммунной и неиммунизированных микросреды в установленных подкожной мышиных опухоли

Здесь мы описываем метод для разделения и обогатить компоненты иммунной и неиммунизированных микроокружения опухоли в установленных подкожной опухоли. Эта техника позволяет для отдельного анализа иммунной инфильтрата опухоли и опухоли неиммунизированных фракций, допускающие всеобъемлющей характеристика иммунной микроокружения опухоли.

Общая цель этого метода заключается в том, чтобы обеспечить метод одновременного профилирования как иммунных, так и раковых клеточных фракций, вносящих свой вклад в иммунное микроокружение солидных опухолей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунной онкологии, например, какие иммунные и неиммунные серийные изменения происходят в опухоли после данного лечения. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она способствует эффективному обогащению опухолевых иммунных и неиммунных компонентов, позволяя тщательно профилировать иммунологическое состояние опухоли.

Общая цель этого метода заключается в эффективном профилировании иммунного микроокружения опухоли и выявлении изменений, вызванных лечением. После распыления на мышь 70% этанола для предотвращения загрязнения волос хирургическим путем удалите подкожные опухоли, следя за тем, чтобы опухоли не содержали никаких загрязняющих тканей. Затем поместите каждую опухоль в 1,8 миллилитра базового средства RPMI 1640 среды без фетальной бычьей сыворотки в индивидуальные лунки 24-луночного планшета на льду.

Когда все опухоли будут собраны, с помощью ножниц разрежьте образцы на кусочки размером менее одного кубического миллиметра и добавьте 200 микролитров свежеприготовленного диссоциативного коктейля 10X, содержащего коллагеназу-1, коллагеназу-4 и ДНКазу, по одному в каждую лунку. Через час при температуре 37 градусов Цельсия в встряхивателе орбитальных пластин со скоростью от 60 до 100 об/мин нейтрализуйте реакцию одним миллилитром среды RPMI 1640 с добавлением 5% FBS и двумя миллимолярными ЭДТА, и используйте модифицированный наконечник пипетки объемом один миллилитр для переноса каждого образца опухолевой суспензии в отдельные 50-миллилитровые конические пробирки, увенчанные индивидуальными 40-микрометровыми фильтрами. С помощью поршня шприца объемом 10 миллилитров механически дезагрегируйте фрагменты опухоли через сетчатые фильтры, периодически промывая каждое ситечко двумя миллилитрами среды RPMI 1640 плюс 5% FBS до тех пор, пока сита не очистятся от опухоли.

Когда все опухоли будут диссоциированы, добавьте среду в каждую пробирку по мере необходимости, чтобы довести все образцы до одного и того же объема, и гранулируйте клетки центрифугированием. Затем используйте пятимиллилитровую серологическую пипетку для ресуспендирования гранул в двух миллилитрах среды, дополненной FBS, на пробирку. Чтобы разделить иммунную и опухолевую фракции клеток, добавьте три миллилитра градиентной среды плотности на дно одной 15-миллилитровой конической пробирки на образец и медленно нанесите два миллилитра суспензии опухолевых клеток вниз по бокам каждой пробирки на каждый градиент.

Убедитесь, что суспензии опухолевых клеток хорошо перемешаны перед нанесением слоев, что клеточные суспензии медленно пипетируются вниз по стенкам пробирок и что с пробирками обращаются осторожно, чтобы предотвратить смешивание слоев. Разделите клетки с помощью центрифугирования с градиентом плотности и тщательно соберите верхнюю среду и инфильтрирующие опухоль слои лейкоцитов в одну новую пробирку объемом 15 миллилитров на образец. Выбросьте оставшуюся среду градиента плотности и повторно суспендируйте опухолевые гранулы в двух миллилитрах среды плюс FBS на пробирку.

Затем центрифугируйте все образцы и ресуспендируйте опухоль, инфильтрируя лейкоциты в 200 микролитриях и опухолевые клетки в двух миллилитрах среды плюс FBS на пробирку на льду. Чтобы покрыть клетки, пометьте одну 96-луночную U-образную пластину для каждой панели иммунного окрашивания плюс дополнительную пластину для подсчета клеток и распределите одиночные клеточные суспензии на каждой из пластин окрашивающей панели и кальковой пластине. Промойте клетки два раза 200 микролитрами PBS Dulbecco на образец и заблокируйте клетки 50 микролитрами FC-блока на лунку на 20 минут при четырех градусах Цельсия.

В конце блокирующей инкубации добавьте 50 микролитров 2X концентрированного внеклеточного антитела-мишени и смеси для окрашивания на фиксированную жизнеспособность в каждую лунку для 30-минутной инкубации в темноте. По окончании окрашивающей инкубации образцы дважды промыть с помощью буфера FACS и повторно суспендировать гранулы в 200 микролитрах раствора фиксации и пермеабилизации на ночь при четырех градусах Цельсия в защищенном от света месте. На следующий день соберите клетки центрифугированием, а затем промойте 200 микролитрами буфера для пермеабилизации на лунку.

Пометьте клетки 100 микролитрами панели окрашивания внутриклеточных антител в буфере для пермеабилизации в течение 30-минутной инкубации в темноте, после чего следует еще одна промывка буфером для пермеабилизации. Затем клетки снова промывают буфером FACS и ресуспендируют образцы в 300 микролитрах свежего буфера FACS для их анализа с помощью проточной цитометрии. Расщепление опухоли, как показано, с обогащением среды градиентом плотности или без него, приводит к примерно 70-90% жизнеспособной популяции целых опухолевых клеток, оцененной с помощью проточной цитометрии.

Обогащение среды градиентом плотности способствует более чем двукратному увеличению CD45-положительной инфильтрирующей опухоль лейкоцитарной фракции по сравнению с необогащенными опухолевыми расщеплениями, а также многочисленными субпопуляциями иммунных клеток, обычно наблюдаемыми в исследованиях иммунного микроокружения. Фракция CD45 отрицательных опухолевых клеток также может быть профилирована по многочисленным опухолевым признакам, таким как общая жизнеспособность опухоли или апоптоз, пролиферативная способность и экспрессия различных иммуносупрессивных маркеров. Чтобы определить, как изменяются миелоидные и лимфоцитарные иммунологические субпопуляции в пределах одной солидной опухоли, опухоль может быть разделена на четыре равные части таким образом, чтобы каждая секция содержала примерно равные внутриопухолевые области, а также равные участки, обращенные к коже и брюшине.

Каждый кусочек затем может быть расщеплен отдельно и проанализирован, как показано, на наличие различных популяций иммунных клеток. После освоения эта техника может быть выполнена за четыре-8 часов, в зависимости от того, сколько сэмплов у вас есть. При попытке выполнить эту процедуру важно работать быстро, но эффективно, чтобы сохранить жизнеспособность клеток.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы диссоциации и разделения включают в себя техники, которые трудно освоить только с помощью письменного текста. После этой процедуры может быть выполнена проточная цитометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как изменяются клеточные популяции внутри опухоли, как с точки зрения численности, так и фенотипа. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как разделять и анализировать как иммунные, так и неиммунные компоненты установленной подкожной опухоли мыши с помощью продемонстрированных методов разделения пищеварения и градиента плотности.