Подавление Pro фиброзный сигнализации потенцирует фактор опосредованной перепрограммирования мыши эмбриональных фибробластов в индуцированной кардиомиоцитов

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области перепрограммирования сердца, такие как определение того, какие пути способствуют или восстанавливают кардиомиогенез. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем генерировать функционально индуцированные кардиомиоциты с более высокой эффективностью, чем ранее опубликованные методы. Эти химические заболевания сердца приводят к потере кардиомиоцитов и нарушению функции сердца.

Таким образом, этот метод может помочь в высоком ремонте, превращая фибробласты в функционально индуцированные кардиомиоциты. Чтобы начать производство ретровируса, выращивайте клетки Platinum E, или PE в среде PE. Дополните его маркерами выбора в тарелке 10 см, в шкафу второго уровня биобезопасности.

Каждые два дня проходите через клетки, от одного до четырех, или от одного до пятого дилюзии. За сутки до планируемой трансфекции засейте ПЭ клетки в 10 мл питательной среды, в 10 см чашку для культивирования, а затем осторожно покачайте чашки вперед и назад. Осторожно поместите посуду в инкубатор, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, и инкубируйте в течение 24 часов.

В день трансфекции добавьте коктейль GHMT2M в тубу объемом 1,5 мл. Далее добавьте 360 микролитров уменьшенной сыворотки среды, в отдельную пробирку объемом 1,5 мл. Затем добавьте 36 микролитров реагента для трансфекции в уменьшенную среду сыворотки и аккуратно переведите пробирку для перемешивания.

Выдерживать при комнатной температуре в течение пяти минут. Реагент для трансфекции, используемый на этом этапе, связывается с пластиком. Чтобы избежать эффективности трансфекции, будьте осторожны с пипеткой реагента для трансфекции непосредственно в уменьшенную сывороточную среду и избегайте прикосновения наконечника пипетки к стенке трубки.

Затем добавьте в пробирку смесь реагентов для трансфекции восстановленных сывороточных сред, содержащую коктейль ДНК GHMT2M. Осторожно переверните пробирку, чтобы перемешать, и выдерживайте при комнатной температуре в течение 15 минут. Наконец, добавьте трансфекционную реакционную смесь по каплям в полиэтиленовые ячейки.

Аккуратно помешивайте блюдо в течение 10-15 секунд. Инкубируйте трансфицированные клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16-20 часов. Теперь покройте посуду диаметром 60 мм коллагеном и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение минимум двух часов.

Затем разложите только что размороженные эмбриональные фибробласты мышей или МЭФ в посуду, покрытую коллагеном. И добавьте питательную среду в конечный объем, 4 мл на чашку 60 мм. Аккуратно покачиваем посуду, и помещаем ее в инкубатор.

При нанесении MEF важно, чтобы клетки были равномерно покрыты. Избегайте закручивания посуды, это может привести к неравномерной сервировке. Вместо этого аккуратно покачивайте чашку вперед и назад и осторожно поместите ее в инкубатор.

Через 24 часа после трансфекции ТЭЛА используйте шприц объемом 30 мл для сбора ретровирусной среды, вырабатываемой клетками. Пропустите первый сбор ретровирусной среды через фильтр размером 45 микрометров в коническую пробирку объемом 50 мл. Затем добавьте 10 мл свежей питательной среды на стенку посуды, стараясь не сместить полиэтиленовые ячейки.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия еще 24 часа. Затем добавьте 7,2 микролитра 10 мг на миллилитр реагента для трансдукции гексидина метрина бромида в 50 мл конической пробирки, содержащей вирусный надосадочный код. Теперь аспирируйте среду из MEF и добавьте в блюдо 4 мл свежесобранной ретровирусной среды.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Через 48 часов после трансфекции клеток ТЭЛА соберите ретровирусную среду и выполните трансдукцию точно так же, как и при первом сборе. После второго сбора ретровирусной среды утилизируйте клетки ПЭ и добавьте 10% отбеливателя во все материалы, контактирующие с ретровирусной средой.

После инкубации отсадите ретровирусную среду из MEFs и добавьте 4 мл среды ICM, содержащей 05 микромоляров, ингибитор рецептора TGF Beta типа 1. Каждые два дня меняйте среду ICM, вплоть до дальнейшего использования. Чтобы начать иммуноокрашивание, аспирируйте среду ICM с 14-го дня перепрограммированных MEF.

Затем промойте ячейки один раз 1 мл ледяного PBS 1X на лунку 12-луночной пластины. Далее отсасывайте PBS, добавляйте 500 микролитров 2%-ного параформальдегида для фиксации клеток, и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. После аспирации параформальдегида трижды промойте клетки 1 мл PBS.

После аспирации PBS добавьте 500 микролитров. 02%Triton X 100 и выдерживайте 15 минут при комнатной температуре. После аспирации Triton X 100 заблокируйте клетки 500 микролитрами 10% лошадиной сыворотки на 30 минут при комнатной температуре.

Далее аспирируйте лошадиную сыворотку, и добавьте 500 микролитров разведенного первичного антитела. Выдерживать в течение одного часа при комнатной температуре. После аспирации первичного антитела трижды промыться 1 мл PBS.

После последнего промывки PBS добавьте 500 микролитров разведенного вторичного антитела. Заверните тарелку в фольгу и выдерживайте в темноте, в течение одного часа при комнатной температуре. Наконец, аспирируйте вторичное антитело и трижды промойте 1 мл PBS.

Заверните пластину в фольгу и храните при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока не будет завершена визуализация. Этот метод показывает высокую эффективность превращения MEF в кардиомиоциты. Репрезентативный анализ проточной цитометрии, добавленный на девятый день после трансдукции, показывает активированную экспрессию сердечного тропонина Т примерно в 70% клеток.

Аналогичным образом, экспрессия альфа-актинина в сердце наблюдается примерно в 55% клеток по сравнению с контролем трансдукции GFP. Кроме того, иммуноокрашивание на сердечные маркеры, проведенное через две недели после трансдукции, показало, что большинство клеток экспрессируют тропонин I, альфа-актинин и тропонин T. Белок щелевого соединения Cx43 также был обнаружен вдоль периферии ICM. Кроме того, совместное мечение ICM с альфа-актинином или тропонином T и Cx43 выявляет образование щелевых соединений между соседними клетками.

Трансдукция GHMT2M и обработка A83O1 перепрограммируют фракцию MEF в бьющиеся клетки к восьмому дню. На 11 день наблюдается примерно 10000 битых клеток на квадратный сантиметр. Спонтанные кальциевые транзиенты, обнаруживаются в бьющихся кардиомиоцитах.

Добавление бета-адренергического агониста изопротеренола, значительно увеличивает частоту спонтанных кальциевых переходных процессов. Напротив, крамола блокатором кальциевых каналов L-типа нифедипином значительно снижает частоту кальциевых переходных процессов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как с высокой эффективностью перепрограммировать фибробласты в функциональные, индуцированные кардиомиоциты.

Следуя этому протоколу, другие методы, включая секвенирование РНК и секвенирование чипов, могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы, такие как глобальная экспрессия генов и статус хроматина, которые изменяются во время перепрограммирования сердца. Не забывайте, что работа с ретровирусом может быть опасной. При выполнении этого протокола всегда должны соблюдаться меры предосторожности, такие как работа в шкафу второго уровня биологической безопасности, ношение средств индивидуальной защиты и надлежащая утилизация всех ретровирусных отходов.