Многоцветные локализации микроскопия одного мембранных белков в органеллами живой Mammalian клеток

Этот метод может ответить на ключевые вопросы регуляторных процессов, например, какую роль играют динамика и организация белка в функциональной адаптации. Основное преимущество этой методики заключается в том, что ее можно проводить в живых клетках, тем самым выявляя динамику белка на уровне одной молекулы. Хотя этот метод был первоначально реализован для получения представления о пространственно-временной организации белков митохондриальных мембран, он также может быть применен к другим органеллам и другим мембранным белкам.

Демонстрировать эту технику будет Тимо Аппельханс, аспирант из моей лаборатории. После трансфекции и подготовки образцов клеток и микроскопа в соответствии с текстовым протоколом смонтируйте подготовленный образец с флуоресцентными шариками в держателе образца между кольцом из ПТФЭ и красным резиновым кольцом. Запустите микроскоп, все аппаратные компоненты и все программное обеспечение, необходимое для микроскопии.

Используйте свежую безворсовую салфетку, сбрызганную изопропанолом, для очистки линзы объектива и нижней части защитного стекла. Затем нанесите каплю иммерсионного масла на зрачок линзы объектива. Затем поместите держатель образца с образцом шарика на предметный столик микроскопа так, чтобы нижняя часть крышки контактировала с маслом.

Затем сосредоточьтесь на бусинах с помощью пропускающего света или лазерной линии. Отрегулируйте мощность двух возбуждающих лазеров для достижения одинаковой плотности сигнала в двух флуоресцентных каналах. Затем найдите область с большим количеством отчетливых флуоресцентных сигналов.

Создайте объединенное представление флуоресцентных каналов с помощью программного обеспечения для управления камерой. Затем с помощью винтов на разветвителе изображения вручную наклоните внутренний оптический разветвитель изображения, чтобы добиться наилучшего наложения сигналов от двух флуоресцентных каналов. Запустите программное обеспечение для управления микроскопом TIRF и выберите отображение отдельных каналов в режиме прямой трансляции.

Сделайте моментальный снимок, возбуждающий флуоресцентные лампы во всех каналах. Затем используйте это изображение для создания матрицы преобразования. Запустите плагин анализа программного обеспечения и загрузите ранее записанные двухцветные изображения флуоресцентных шариков в программное обеспечение.

Выберите используемую ориентацию флуоресцентных каналов. Нажмите «Да», когда появится запрос на калибровку изображений, и выберите ранее сделанный снимок. Откройте диспетчер единиц измерения, чтобы определить коэффициенты преобразования единиц измерения, затем откройте диспетчер локализации.

Чтобы определить функцию распределения точек, или PSF, нажмите кнопку PSF Radius. В открывшемся окне Оценщик PSF определите числовую апертуру и максимум излучения. Затем нажмите кнопку Оценить радиус PSF.

Далее примем полученный экспериментальный PSF. Определим поле оценки, количество петель дефляции и количество ядер компьютера, используемых для расчета. Затем нажмите кнопку «Локализовать», чтобы начать подгонку распределения интенсивности отдельных частиц с помощью 2D-симметричной функции Гаусса.

Откройте диспетчер калибровки. На визуализированном, объединенном изображении двух каналов будет показан исходный сигнал и локализованные центры. Выберите режим «Аффинный».

Затем вручную соедините соответствующие пары локализованных центров в двух каналах, которые произошли от одной и той же флуоресцентной бусины, проведя соединительную линию. Подключите соответствующие сигналы, распределенные по полю зрения. Затем нажмите Принять и сохраните матрицу преобразований.

Чтобы провести одномолекулярную визуализацию белков митохондриальной мембраны, установите защитное кольцо образца между резиновым кольцом и кольцом из ПТФЭ. Затем заполните камеру от 0,5 до 0,8 миллилитров среды для визуализации. Очистите линзу объектива и нижнюю часть крышки.

Затем используйте просвечивающий свет или лазерную линию для фокусировки на ячейках, предварительно добавив каплю масла в линзу. Затем отрегулируйте мощность двух возбуждающих лазеров, чтобы достичь одинаковой интенсивности, и найдите область с большим количеством флуоресцентных сигналов. Отрегулируйте угол освещения в управляющем программном обеспечении микроскопа TIRF, чтобы создать угол падения, меньший, чем критический угол, или в режиме TIR, чтобы возбудить конкретную область интереса с помощью листа HILO.

Адаптация освещения микроскопа TIRF для возбуждения клеточных органелл с помощью освещения HILO требует быстрой оценки соотношения сигнал/фон и опыта в микроскопии TIRF, а также знания морфологии клеток. Установите усиление ЭМ и выберите подходящее для эксперимента время экспозиции, которое собирает достаточное количество фотонов на кадр. Затем отрегулируйте мощность лазера для достижения высокого соотношения сигнал/шум, так как это соотношение напрямую соответствует точности локализации.

Найдите область на периферии клетки с неперекрывающимися, удлиненными митохондриями и одномолекулярными сигналами. Если в одном или обоих каналах не видно ни одного сигнала, подождите, пока обесцвечивание не приведет к появлению одномолекулярных сигналов. В случае, если необходимо отбелить только один канал, выключите лазер другого канала, чтобы избежать обесцвечивания, перед записью этого канала.

Записывайте до тех пор, пока количество сигналов не станет слишком низким для разумного продолжения. Запустите программное обеспечение для обработки изображений и проверьте наличие митохондриальных структур, создав совокупное изображение с отрисованной суммой, содержащее не менее 1000 записанных кадров. Запустите плагин анализа программного обеспечения.

Чтобы провести обработку данных для локализации и отслеживания, загрузите исходные данные. Проверьте многоцветность. Выберите правильную ориентацию обоих каналов.

Когда появится запрос на калибровку изображений, загрузите матрицу преобразований. Каналы будут отображаться отдельно. Откройте необработанные данные из контейнера изображений, нажав кнопку Показать.

Затем откройте менеджер единиц измерения в верхней вкладке и определите коэффициенты конвертации единиц измерения в каждом канале. Откройте менеджер локализации в верхней вкладке и определите поле оценки и количество петель дефляции. Нажмите на Радиус PSF, чтобы открыть оценщик PSF.

Установите числовую апертуру и максимум излучения, чтобы получить теоретическое значение PSF. Нажмите «Принять». Повторите это для всех каналов.

Затем нажмите кнопку Локализовать, чтобы начать локализацию отдельных частиц для записанных сигналов в обоих каналах. Дождитесь завершения работы программного обеспечения. Теперь в контейнере изображений плагина программного анализа получается изображение со сверхвысоким разрешением для каждого канала.

PINK1 является важным фактором, гарантирующим функциональность митохондрий. Для определения локализации PINK1 относительно Tom20 в функциональных и дисфункциональных митохондриях был записан временной ряд из 1000 кадров. Кумулятивное изображение всех сигналов с течением времени из одного канала показало, что PINK1 локализован в цитозоле, на внешней мембране и внутри митохондрий в нормальных условиях, но преимущественно во внешней мембране деполяризованных митохондрий.

Как показывают суммированные изображения локализованных частиц, PINK1 распределен в основном внутри поляризованных митохондрий, в то время как Tom20 локализован во внешней митохондриальной мембране. Это становится еще более очевидным на объединенном изображении локализованных частиц Tom20 и PINK1, которое показывает, что распределение белка внешней мембраны Tom20 гораздо шире. Для проверки локализации PINK1 внутри митохондрий 30-килодальтонную субъединицу первого дыхательного комплекса слили с фотоактивируемым GFP и зарегистрировали с помощью флуоресцентной фотоактивационной микроскопии.

Совокупное трехцветное изображение и распределение поперечного сечения показывают наложение complex one и PINK1, что подтверждает импорт PINK1 в полный рост. Эти данные демонстрируют, что субпопуляции PINK1 занимают несколько митохондриальных микрокомпартментов. После освоения эта техника может быть выполнена за 20 часов, включая запись и постобработку данных, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать проверять движение органелл. После этой процедуры можно определить относительную локализацию белков. После своего развития эта методика открыла путь исследователям в области отслеживания митохондриальных белков с помощью одиночных частиц, чтобы наблюдать за их поведением в Z2 и различных метаболических условиях, а также при стрессе.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить двухколоночную микроскопию митохондриальных белков, чтобы выявить их суборганелльное положение и транспорт.