Оптимизированный скретч Assay в Vitro тестирования миграции клеток с автоматической оптической камеры
8 августа 2018 г.
Здесь мы опишем процедуру тест ячейка миграции в пробирке с автоматической оптической камеры микроскопа. Царапинам assay широко используется где закрытие нуля следуют за определенный период. Оптический микроскоп обеспечивает надежный и дешевый обнаружение миграции клеток.
Главное преимущество данной методики заключается в том, что в автоматический оптический микроскоп можно смотреть на клетки в режиме реального времени. Последствия этого лечения распространяются на терапию хронических ран или рака, где миграция играет решающую роль в этих заболеваниях. Начните с двукратной промывки конфлюентной культуры клеток HaCaT пятью миллилитрами стерильного магния и кальция PBS на одну промывку.
Затем инкубируйте клетки с одним миллилитром трипсина в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение пяти-восьми минут. После подтверждения отслойки под световым микроскопом прекращают ферментативную реакцию с девятью миллилитрами питательной среды, дополненной FBS. И разбавьте клетки до 7,5 умно-10 на четвертую ячейки на 250 микролитров среды плюс концентрацию FBS.
Затем засейте по 250 микролитров клеток в каждую лунку 48-луночного планшета для культуры тканей с круглым дном и осторожно сдвиньте пластину из стороны в сторону, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены по дну лунки. Затем перенесите планшет в инкубатор для клеточных культур. Когда культуры достигнут конфлюенции от 90 до 95%, замените надосадочную жидкость в каждой лунке на 250 микролитров свежеприготовленной среды с добавлением 10 микрограммов на миллилитр митомицина С, и верните планшет в инкубатор еще на два часа.
По окончании инкубации промойте клетки 250 микролитрами PBS и добавьте в каждую лунку по 250 микролитров свежих PBS. Затем с помощью наконечника микропипетки объемом 200 микролитров сделайте по одной вертикальной царапине в каждом монослое клетки. Когда все монослои будут поцарапаны, замените PBS в каждой лунке на 250 микролитров с интересующим пептидным стимулом и установите пластину в оптическую систему камер с неповрежденной крышкой.
Чтобы настроить оптическую камеру, откройте окно получения и выберите «Заживление ран». Выберите тип пластины и отмените выделение неиспользуемых скважин. Затем нажмите кнопку «Включить» и щелкните правой кнопкой мыши по одной из лунок, чтобы отрегулировать фокус в соответствии с положением ячеек.
Установите период времени для изображений в разделе Интервал изображения и установите количество повторений в соответствии с нужным периодом. Затем выберите подходящий тип анализа. Затем нажмите «Пуск», чтобы начать визуализацию клеток.
Когда возникает рана, клетки кожи начинают пролиферировать и мигрировать через раневое ложе, чтобы закрыть рану, процесс, который можно наблюдать через оптическую камеру. После 48-часовой инкубации лечение эндотелиальным фактором роста индуцирует почти 95% закрытие раны, по сравнению с 38% закрытием в необработанных контрольных лунках и 33 и 62% закрытием в культурах лактоферрина и лактоферрицина соответственно. Процент закрытия раны, определенный по изменению ширины разрыва от первоначальной царапины, также может быть построен на графике для каждого стимула роста.
В этом видео описывается простой и эффективный протокол изучения миграции кератиноцитов через царапину, сделанную в монослое здоровых клеток. Несмотря на то, что в этом анализе используются клетки HaCaT, этот метод также может быть применен к другим клеточным линиям, грибам или даже бактериям, при условии, что они прилегают к нижней части микротитровой пластины.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается процедура тестирования миграции клеток in vitro с использованием автоматизированного оптического микроскопа с камерой. Тест на заживление царапины (scratch assay) представлен как надежный метод наблюдения за миграцией клеток во времени.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Микроскопия
- Методы in vitro
Теоретические основы
- Метод «царапания» (scratch assay) является широко используемым подходом для изучения миграции клеток.
- Автоматизированные оптические микроскопы обеспечивают наблюдение за клетками в режиме реального времени.
- Понимание механизмов клеточной миграции имеет решающее значение для терапии хронических ран и рака.
- Данный метод является экономически эффективным и надежным способом регистрации перемещения клеток.
Цель исследования
- Продемонстрировать надежный метод оценки миграции клеток.
- Изучить значение миграции клеток для лечения хронических ран и терапии рака.
- Использовать автоматизированную оптическую микроскопию для анализа в режиме реального времени.
Используемые методы
- Промывка конфлюэнтных культур клеток HaCaT раствором PBS.
- Инкубация клеток с трипсином для их открепления.
- Остановка ферментативной реакции с помощью культуральной среды.
- Разведение клеток до определенной концентрации для проведения анализа.
Основные результаты
- Было осуществлено наблюдение за миграцией клеток в режиме реального времени.
- Метод доказал свою эффективность для мониторинга закрытия «царапины» (scratch closure).
- Результаты могут быть использованы при разработке терапевтических стратегий лечения хронических ран и рака.
- Автоматизированная микроскопия повышает достоверность оценки миграции.
Выводы
- Автоматизированный оптический микроскоп является ценным инструментом для изучения миграции клеток.
- Данный метод может способствовать развитию исследований в области заживления хронических ран и терапии рака.
- Дальнейшие исследования могут расширить возможности его применения в различных биологических контекстах.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Тесты на миграцию клеток имеют решающее значение для оценки терапевтических кандидатов в области заживления ран и онкологии, однако традиционные методы «царапания» (scratch assays) подвержены влиянию краевых артефактов и ограничениям, связанным с ручным анализом. Данный оптимизированный протокол решает проблему воспроизводимости за счет устранения катион-опосредованного накопления клеток и интеграции автоматизированной визуализации, что обеспечивает получение стабильных количественных показателей миграции. Этот подход способствует валидации мишеней на ранних стадиях и снижению механистических рисков, предоставляя надежные данные в реальном времени о промиграционных и антимиграционных соединениях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного анализа изменений миграции в ответ на такие стимулы, как лактоферрин или факторы роста.
- Практическая ценность: снижает вариабельность, характерную для ручного анализа «царапин» и температурных колебаний, за счет использования автоматизированной оптической визуализации.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать стандартизированные количественные показатели закрытия раны на идентичных участках царапины с течением времени.
- Практическая ценность: устраняет трудоемкий процесс циклического переключения и анализа изображений, что повышает пропускную способность при скрининге соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Использование кератиноцитов HaCaT, имеющих значение для изучения заболеваний, для моделирования эпителиальной миграции, что способствует согласованию трансляционных биомаркеров.
- Практическая ценность: Обеспечение непрерывности анализа от этапа поиска до доклинической оценки с помощью воспроизводимых автоматизированных рабочих процессов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий, поддерживая проверку гипотез на ранних этапах поиска и обеспечивая количественную идентификацию перспективных соединений-лидеров посредством измеримого ингибирования или стимуляции миграции.
- Открывающая биология: способствует уточнению путей передачи сигнала путем изоляции миграции в качестве зависимой переменной в ответ на воздействие пептидов или цитокинов.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты (например, % закрытия раны), что позволяет проводить сравнение библиотек соединений или вариантов белков.
- Аналитика: генерирует временные ряды данных о миграции, подходящие для статистического сравнения и моделирования зависимости «доза-эффект».
- Трансляционные исследования: обеспечивает преклиническую значимость за счет использования кератиноцитов человека и контекста заживления ран.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую автоматизированную платформу для проведения анализов миграции в рамках множества проектов и для различных типов клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет снижения механистической неопределенности в анализах миграции.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и масштабируемость благодаря автоматизированной визуализации и единообразной подготовке царапин.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя надежные количественные данные о миграции на ранних этапах процесса.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию соединений с учетом рисков на основе подтвержденных эффектов миграции.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с культурами клеток и владение методами стерильной работы для подготовки монослоя.
- Метод основан на использовании автоматизированных систем оптических камер с возможностью таймлапс-съемки и анализа.
- Необходима стандартизация ширины царапины и времени проведения процедуры во всех лунках для получения сопоставимых данных.
- Требуется оптимизация этапов промывки PBS для предотвращения артефактов по краям для различных клеточных линий.
- Метод ограничен применением адгезивных клеток, способных прикрепляться к дну микротитрационного планшета.
