Оптимизированный скретч Assay в Vitro тестирования миграции клеток с автоматической оптической камеры
August 8th, 2018
Здесь мы опишем процедуру тест ячейка миграции в пробирке с автоматической оптической камеры микроскопа. Царапинам assay широко используется где закрытие нуля следуют за определенный период. Оптический микроскоп обеспечивает надежный и дешевый обнаружение миграции клеток.
Главное преимущество данной методики заключается в том, что в автоматический оптический микроскоп можно смотреть на клетки в режиме реального времени. Последствия этого лечения распространяются на терапию хронических ран или рака, где миграция играет решающую роль в этих заболеваниях. Начните с двукратной промывки конфлюентной культуры клеток HaCaT пятью миллилитрами стерильного магния и кальция PBS на одну промывку.
Затем инкубируйте клетки с одним миллилитром трипсина в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение пяти-восьми минут. После подтверждения отслойки под световым микроскопом прекращают ферментативную реакцию с девятью миллилитрами питательной среды, дополненной FBS. И разбавьте клетки до 7,5 умно-10 на четвертую ячейки на 250 микролитров среды плюс концентрацию FBS.
Затем засейте по 250 микролитров клеток в каждую лунку 48-луночного планшета для культуры тканей с круглым дном и осторожно сдвиньте пластину из стороны в сторону, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены по дну лунки. Затем перенесите планшет в инкубатор для клеточных культур. Когда культуры достигнут конфлюенции от 90 до 95%, замените надосадочную жидкость в каждой лунке на 250 микролитров свежеприготовленной среды с добавлением 10 микрограммов на миллилитр митомицина С, и верните планшет в инкубатор еще на два часа.
По окончании инкубации промойте клетки 250 микролитрами PBS и добавьте в каждую лунку по 250 микролитров свежих PBS. Затем с помощью наконечника микропипетки объемом 200 микролитров сделайте по одной вертикальной царапине в каждом монослое клетки. Когда все монослои будут поцарапаны, замените PBS в каждой лунке на 250 микролитров с интересующим пептидным стимулом и установите пластину в оптическую систему камер с неповрежденной крышкой.
Чтобы настроить оптическую камеру, откройте окно получения и выберите «Заживление ран». Выберите тип пластины и отмените выделение неиспользуемых скважин. Затем нажмите кнопку «Включить» и щелкните правой кнопкой мыши по одной из лунок, чтобы отрегулировать фокус в соответствии с положением ячеек.
Установите период времени для изображений в разделе Интервал изображения и установите количество повторений в соответствии с нужным периодом. Затем выберите подходящий тип анализа. Затем нажмите «Пуск», чтобы начать визуализацию клеток.
Когда возникает рана, клетки кожи начинают пролиферировать и мигрировать через раневое ложе, чтобы закрыть рану, процесс, который можно наблюдать через оптическую камеру. После 48-часовой инкубации лечение эндотелиальным фактором роста индуцирует почти 95% закрытие раны, по сравнению с 38% закрытием в необработанных контрольных лунках и 33 и 62% закрытием в культурах лактоферрина и лактоферрицина соответственно. Процент закрытия раны, определенный по изменению ширины разрыва от первоначальной царапины, также может быть построен на графике для каждого стимула роста.
В этом видео описывается простой и эффективный протокол изучения миграции кератиноцитов через царапину, сделанную в монослое здоровых клеток. Несмотря на то, что в этом анализе используются клетки HaCaT, этот метод также может быть применен к другим клеточным линиям, грибам или даже бактериям, при условии, что они прилегают к нижней части микротитровой пластины.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В этой статье описывается процедура для тестирования миграции клеток in vitro с использованием автоматизированного оптического микроскопа с камерой. Метод со скребком выделяется как надежный способ наблюдения за миграцией клеток со временем.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- МикросCOPия
- In Vitro методы
Предпосылки
- Метод со скребком является широко используемой техникой для изучения миграции клеток.
- Автоматизированные оптические микроскопы обеспечивают наблюдение за клетками в реальном времени.
- Понимание миграции клеток имеет важное значение в терапии хронических ран и рака.
- Этот метод является экономически эффективным и надежным для выявления движения клеток.
Цель исследования
- Демонстрировать надежный метод оценки миграции клеток.
- Исследовать значимость миграции клеток в лечении хронических ран и терапии рака.
- Использовать автоматизированную оптическую микроскопию для анализа в реальном времени.
Используемые методы
- Промывание конфлуэнтных культур клеток HaCaT с PBS.
- Инкубация клеток с трипсином для отсоединения.
- Остановка ферментативной реакции средой культивирования.
- Разведение клеток до определенной концентрации для анализа.
Основные результаты
- Было достигнуто наблюдение за миграцией клеток в реальном времени.
- Метод оказался эффективным для мониторинга закрытия со скребком.
- Результаты могут повлиять на терапевтические стратегии для хронических ран и рака.
- Автоматизированная микроскопия повышает надежность оценки миграции.
Выводы
- Автоматизированный оптический микроскоп является ценным инструментом для изучения миграции клеток.
- Эта техника может способствовать прогрессу в исследованиях заживления хронических ран и терапии рака.
- Дальнейшие исследования могут расширить ее применение в различных биологических контекстах.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Cell migration assays are critical for evaluating therapeutic candidates in wound healing and oncology, yet traditional scratch assays suffer from edge artifacts and manual analysis bottlenecks. This optimized protocol addresses reproducibility challenges by eliminating cation-mediated cell accumulation and integrating automated imaging, enabling consistent, quantitative migration readouts. The approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by providing reliable, real-time data on pro- and anti-migratory compounds.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying migration changes in response to stimuli like lactoferrin or growth factors.
- Operational Value: Reduces variability from manual scratch analysis and temperature fluctuations through automated optical imaging.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative wound closure metrics from identical scratch sections over time.
- Operational Value: Eliminates labor-intensive image cycling and analysis, improving throughput for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant HaCaT keratinocytes to model epithelial migration, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Ensures assay continuity from discovery to preclinical evaluation via reproducible, automated workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting hypothesis testing in early discovery and enabling quantitative lead identification through measurable migration inhibition or stimulation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating migration as a dependent variable in response to peptide or cytokine treatments.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs (e.g., % wound closure) that allow comparison across compound libraries or protein variants.
- Analytics: Generates time-series migration data suitable for statistical comparison and dose-response modeling.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance through use of human keratinocyte cells and wound-healing context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for migration assays across multiple projects and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in migration assays.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through automated imaging and consistent scratch preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable, quantitative migration data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated migration effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture and sterile technique for monolayer preparation.
- Dependent on automated optical camera systems with time-lapse and analysis capabilities.
- Necessitates standardization of scratch width and timing across wells for comparable data.
- Involves optimization of PBS washing steps to prevent edge artifacts in different cell lines.
- Limited to adherent cells compatible with microtiter plate bottom attachment.
