Простой и воспроизводимый метод подготовить образцы мембраны из микрососудов мозга свежевыделенных крыса

Общая цель этой процедуры заключается в выделении церебральных микрососудов из мозга крысы для биохимических исследований, направленных на понимание молекулярных характеристик гематоэнцефалического барьера млекопитающих. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы физиологии гематоэнцефалического барьера и нейрофармакологии, такие как регуляция, локализация и экспрессия белков плотных соединений и эндогенных транспортеров в норме и при заболеваниях. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем выделить достаточное количество высококачественных микрососудов от отдельного животного, учитывая при этом естественную изменчивость экспрессии белка между отдельными животными.

Демонстрировать эту технику будет Бьянка Рейли, выдающаяся студентка бакалавриата из моей лаборатории. После усыпления и обезглавливания крысы Спрэг-Доули в соответствии с текстовым протоколом, с помощью хирургических ножниц можно удалить кожу с черепа крысы, сделав один поперечный разрез. С помощью ронжеров осторожно снимите пластину черепа и обнажите мозг.

Затем с помощью шпателя извлеките орган. Отделите головной мозг и поместите изолированную мозговую ткань в 50-миллилитровую коническую трубку с пятью миллилитрами BMB и 5,0 микролитрами коктейля ингибиторов протеазы. Чтобы обработать ткань, переложите ее в чистую чашку Петри.

Затем с помощью щипцов аккуратно прокатайте мозг по фильтровальной бумаге диаметром 12,5 сантиметров, чтобы удалить наружные мозговые оболочки, которые неплотно прилипают к коре головного мозга. На этом этапе следует позаботиться о том, чтобы вся менингеальная ткань была удалена из образца мозговой ткани. Мозговые оболочки можно визуализировать как прозрачную пленчатую ткань, которая может быть легко оторвана от ткани мозга.

Осторожно прижмите ткань мозга к фильтровальной бумаге и снова сверните ткань, часто переворачивая фильтровальную бумагу во время этого шага. Затем с помощью щипцов отделить сосудистое сплетение от полушарий головного мозга. Затем снова аккуратно расплющите ткани мозга и с помощью щипцов удалите обонятельные луковицы, прилегающие к белому веществу.

Поместите кортикальную ткань мозга в охлажденную стеклянную ступку. Затем добавьте пять миллилитров BMB с коктейлем ингибиторов протеазы. Используя верхний силовой гомогенизатор, вставьте пестик в ступку и гомогенизируйте мозговую ткань 15 движений вверх и вниз со скоростью 3 700 об/мин.

Затем разлейте гомогенат по пробиркам с маркировкой. Между образцами используйте 70% этанол для очистки пестика. Чтобы провести центрифугирование, добавьте 8,0 мл 26%-ного раствора декстрана в каждую меченую центрифужную пробирку, содержащую гомогенат мозга.

Дважды переверните трубку, а затем тщательно закрутите образец. Проведите вихревую обработку каждого образца под разными углами, чтобы обеспечить тщательное смешивание раствора гомогената мозга с 26%-ным раствором декстрана. Центрифугируйте образцы при температуре 5 000 г и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.

Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 5,0 миллилитрах BMB с коктейлем ингибитора протеазы. Затем перебейте гранулу в вихрь, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Затем добавьте 8,0 миллилитров 26%-ного декстрана в каждую центрифужную пробирку и сделайте вихрь, как только что продемонстрировано.

Затем снова центрифугируйте образцы. С помощью вакуумной колбы и стеклянной пипетки аспирируйте надосадочную жидкость и следите за тем, чтобы гранула, содержащая микрососуд мозга, не была нарушена. Повторно суспендируйте гранулу в BMB с ингибитором протеазы, а затем еще два раза 26% декстрана.

После окончательного центрифугирования добавьте 5,0 миллилитров BMB в каждую гранулу и вихрь для ресуспендирования образца. С использованием протокола, показанного в этом видео, было проведено успешное выделение интактных микрососудов из мозга крысы. На этом изображении микрососуд окрашен с помощью антитела против Oatp1a4, транспортера, который хорошо экспрессируется на плазматической мембране микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга.

Как показано в вестерн-блоттинге, мембранные препараты из микрососудов, собранных у самок крыс Sprague-Dawley, были обогащены PECAM-1, также известным как CD31, маркерным белком микроциркуляторного русла головного мозга. В ходе оптимизации этого протокола наблюдалось обогащение PECAM в образцах мембран, полученных с использованием двух и четырех стадий центрифугирования декстрана. Как определено с помощью анализа белка Брэдфорда и приведено в этой таблице, мембранные препараты обычно дают концентрацию белка в диапазоне от 5,0 мг на миллилитр до 10,0 мг на миллилитр.

Значения белка определяли на основе стандартной кривой, которая была сгенерирована с использованием BSA в качестве стандарта. Здесь показан вестерн-блоттинг для транспортного белка ГЭБ Glut1. В каждом образце мембраны были обнаружены четкие одиночные полосы при концентрации 54 килодальтоны для этого высокоэкспрессированного белка ГЭБ.

Этот график иллюстрирует более высокую экспрессию Glut1 на ГЭБ у самцов крыс по сравнению с самками. Различий в экспрессии АТФазы натрия/калия между самцами и самками животных не наблюдалось. После освоения этой техники ее можно выполнить за два-два с половиной часа, если она выполнена правильно.

При проведении этой процедуры важно помнить о том, что все образцы должны находиться на льду на протяжении всего протокола, а также соблюдать осторожность при аспирации надосадочной жидкости из микрососуда после этапов центрифугирования. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как анализ коиммунопреципитации, на образцах микрососудов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как ассоциация различных белков в одном и том же белковом комплексе на гематоэнцефалическом барьере. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области физиологии гематоэнцефалического барьера и нейрофармакологии к изучению молекулярных характеристик гематоэнцефалического барьера в организме здоровья и на моделях неврологических заболеваний у грызунов.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделить высококачественные микрососуды из мозга крысы для ваших собственных исследований биологии гематоэнцефалического барьера в здоровье и болезнях.