Ex Vivo Кальция изображений для визуализации мозга ответы на эндокринных сигнализации в дрозофилы

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эндокринологии, а также в области нейробиологии, например, в нашем исследовании по изучению реакции мозга на эндокринные сигналы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что вы можете исследовать прямое воздействие эндокринных сигналов на мозг, отделенный от других тканей. Чтобы начать эту процедуру, с помощью щипцов поцарапайте нижнюю часть пластиковой чашки для культивирования, чтобы создать вмятину для более легкого монтажа вентрального ганглия головного мозга личинки после вскрытия.

С помощью зубочистки нанесите небольшую каплю суперклея по обе стороны от вмятины, а к клею прикрепите вольфрамовый стержень. Затем, используя небольшой кусочек многоразового клея, похожего на шпаклевку, сделайте круглую стенку вокруг вмятины. Чтобы вскрыть мозг личинки, через 90 – 120 часов после откладки яиц собирают личинок и не менее трех раз промывают их дистиллированной водой для удаления прилипших остатков пищи.

Далее поместите личинку на квадратное полуторадюймовое стекло для часов, наполненное ледяным PBS. С помощью щипцов аккуратно захватите среднюю часть личинки. Используйте еще одну пару щипцов, чтобы осторожно захватить и потянуть за крючки для рта, чтобы отделить переднюю часть личинки, содержащую мозг, от остальной части тела.

Затем возьмитесь щипцами за передний кончик и выверните личинку наизнанку. Удалите посторонние ткани, прикрепленные к мозгу, такие как имагинальные диски, жировые тела и кольцевые железы. Аккуратно отделите мозг от ротовых частей.

После этого нанесите 200 микролитров PBS на внутреннюю часть адгезивного кольца, приготовленного ранее в камере визуализации. Аккуратно всосите препарированный мозг с помощью PBS в пастеровскую пипетку и перенесите его в камеру визуализации. В камере визуализации захватите мышечные волокна, отходящие от вентральных ганглиев и осторожно вставьте мозг в углубление под вольфрамовой проволокой.

Затем слегка потяните вольфрамовую проволоку вверх, чтобы поместить мозг в правильное положение для визуализации. Чтобы получить изображения флуоресценции кальция, поместите камеру визуализации, содержащую эксплант мозга, под микроскоп. Опустите линзу объектива до тех пор, пока она не коснется PBS, и под ярким освещением поля расположите мозг и сфокусируйте его.

Переключитесь на флуоресцентный свет и отрегулируйте фокус на успешно меченых клетках GCaMP. Начните съемку со скоростью 250 мс/кадр с разрешением 512 x 512 пикселей в режиме водяного охлаждения. Затем отрегулируйте время экспозиции для получения значений флуоресценции в пределах динамического диапазона ПЗС-камеры, но не ниже 1000 условных единиц при 16-битном изображении.

После того, как параметры визуализации определены, сделайте снимки за одну минуту до введения пептидов, чтобы определить исходную интенсивность сигнала. Впоследствии применяют исследуемый пептид непосредственно, пипетируя 100 микролитров приготовленного раствора пептида в ванну с личинками. Запишите успешное излучение GCaMP в течение нескольких минут.

Чтобы проанализировать данные, откройте программу для анализа и используйте в качестве эталонного изображения первый кадр, который был до нанесения пептида. Затем выберите Плагины, TurboReg. Выберите файл серийного изображения в качестве источника, а эталонное изображение — в качестве цели.

Далее отметьте Rigid Body и Accurate по способу обработки и качеству соответственно. После этого нажмите кнопку Batch (Пакетная обработка), чтобы начать обработку изображения. Выберите несколько областей интереса с помощью функций «Анализ», «Инструменты», «Диспетчер окупаемости инвестиций» в области изображений.

Затем измерьте интенсивность пикселей, нажав «Еще», «Мультимера», «ОК» в окне «Менеджер ROI». В этом эксперименте мозг дикого типа подвергался воздействию CCHa2, грелина и ноцицептина, в то время как мозг с мутантным рецептором CCHa2 подвергался воздействию CCHa2. Сигналы GCaMP6 в инсулин-продуцирующих клетках были обнаружены с помощью конфокальной микроскопии со скоростью 250 мс/кадр, и вот неподвижные изображения выбранных временных точек.

Построен график отношения изменения интенсивности ROI к интенсивности сигнала базового уровня в каждой временной точке. ROI были установлены на телах клеток, которые были обнаружены в той же фокальной плоскости. Сплошными линиями обозначено среднее значение от 5 до 10 выборок, а пунктирными линиями обозначены верхний и нижний пределы стандартной ошибки среднего значения.

Затененные области указывают на вариацию сигналов в экспериментах. После освоения этой техники ее можно сделать за один час, если она правильно отформована. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о быстрой подготовке образца мозга, чтобы избежать его повреждения.

Эту процедуру можно сочетать с генетикой, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о специфичности рецепторов. Система, используемая в этом протоколе, проста в подготовке и пригодна для повторного использования. Таким образом, этот протокол будет полезен, как и при скрининге.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области эндокринологии и неврологии к изучению гормональных сетей, которые контролируют функцию мозга у дрозофил.