Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет
19 апреля 2018 г.
Мы представляем автоматизированный метод для трехмерной реконструкции Caenorhabditis elegans микрофлорой. Наш метод определяет количество и положение каждого ядра в микрофлорой и анализ распределения белка микрофлорой и цитоскелета структуру.
Общая цель этого метода заключается в автоматизации анализа зародышевой линии Caenorhabditis elegans для изучения ее ядер, белка и распределения цитоскелета. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области C.Elegans о количестве ядер и сперматозоидов, распределении ядра и цитоскелетной структуре зародышевой линии. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он сокращает время анализа, увеличивает размер выборки и исключает человеческую ошибку, связанную с ручным анализом.
Чтобы получить изображение образцов, поместите предметные стекла с окрашенными зародышевыми линиями в держатель предметного стекла над 63-кратным объективом конфокального микроскопа и найдите зародышевую линию. Сфокусируйтесь на верхней части зародышевой линии и отметьте ее с помощью программного обеспечения для конфокального микроскопа. Когда общая толщина зародышевой линии будет определена, определите толщину каждого среза с точностью до 0,5 микрометра и отметьте всю зародышевую линию.
Затем начните сбор данных, сканируя каждый срез восемь раз и усредняя значения для улучшения качества изображения. Когда все изображения будут получены, импортируйте изображения в соответствующую программу для анализа изображений и используйте инструмент функции поверхности для выбора митотической области. Появится изображение дистального конца зародышевой линии.
Отмените работу мастера автоматического создания поверхности и вручную нарисуйте интересующую область вокруг митотической области на первом и последнем срезах изображения из трехмерной стопки. Нажмите кнопку "Создать поверхность", а затем команду "Канал маски", чтобы замаскировать все каналы, кроме канала DAPI. С помощью инструмента функции spot определите параметры размера митотической области с диаметром XY два микрометра и неопределенным диаметром Z.
Нажмите «Вычесть фон», чтобы вычесть фон. Чтобы определить минимальное пороговое значение, увеличьте минимальный порог 3D-рендеринга на зародышевой линии, окрашенной DAPI, до тех пор, пока первое пятно не появится за пределами зародышевой линии, и создайте 3D-модель для каждой области. После сохранения изображений нажмите на таблицу, чтобы просмотреть количество ядер, автоматически сгенерированных программным обеспечением, и экспортируйте изображения в виде файлов TIFF.
Для переходной зоны создайте поверхность, как описано ранее. Затем нажмите кнопку «Маскировать канал», чтобы замаскировать все каналы, кроме канала DAPI. Используя функцию Spot, определите диаметр XY в два микрометра и диаметр Z в 1,5 микрометра и нажмите кнопку Вычесть фон, чтобы вычесть фон.
Чтобы определить минимальное пороговое значение, увеличьте минимальный порог 3D-рендеринга на зародышевой линии, окрашенной DAPI, до тех пор, пока первое пятно не появится за пределами зародышевой линии, и создайте 3D-модель для каждой области. После сохранения изображений нажмите на таблицу, чтобы просмотреть количество ядер, автоматически сгенерированных программным обеспечением, и экспортируйте изображения в виде файлов TIFF. Для оценки числа сперматозоидов выберите сперматеку в качестве области интереса, как показано для областей ядер, и используйте инструмент функции пятна для определения диаметра XY от 0,75 до одного микрометра с неопределенным диаметром Z для обнаружения каждого сперматозоида.
Выберите поле Вычесть фон и используйте значения коррекции фона, рассчитанные программным обеспечением, для вычитания фона. Затем настройте порог 3D-рендеринга, чтобы обнаружить все сперматозоиды, окрашенные DAPI, в сперматеке. Для подсчета хромосом в ооцитах выберите ооциты и определите диаметр XY как менее 0,75 микрометра, а также определите порог перед разработкой 3D-моделей.
Затем сохраните изображения для экспорта в виде файлов TIFF. Для реконструкции зародышевой линии цитоскелета определите интересующую митотическую область в зародышевой линии и создайте поверхностную маску, как было показано ранее. Щелкните Маскировать каналы, чтобы замаскировать все каналы, кроме канала фаллоидина, и используйте инструмент функции поверхности для определения детализации поверхности размером 0,25 микрометра.
После вычитания фона отрегулируйте порог 3D-рендеринга, чтобы сохранить разработанное 3D-изображение для экспорта в виде файла TIFF. Распределение ядер зависит от стадии дифференцировки. Например, в митотической области внутренний актин выглядит как твердая масса, на которой организованы ядра.
В зародышевой линии дикого типа митотическая область содержит примерно 250 ядер и плотно упакована ядрами по сравнению с остальной частью зародышевой линии. Однако по мере удаления ядер от дистального конца они кажутся ближе к окружности зародышевой линии, при этом изменение распределения начинается в переходной зоне и заканчивается, когда ядра вступают в третью стадию профазы в мейозе. В переходной зоне внутренний актин зародышевой линии принимает более цилиндрическую структуру, становясь полым цилиндром по мере достижения пахитена.
Второй слой актина покрывает внутренний слой, придавая форму зародышевой линии. Этот цилиндр в структуре актина цилиндра исчезает по направлению к области ооцита, и в этот момент актин проявляется в виде толстых волокон, покрывающих ооциты. В сперматеке актин также образует толстые пучки волокон, хотя эти волокна, по-видимому, упакованы друг к другу более плотно, чем в области ооцитов.
Трехмерная визуализация проксимального конца зародышевой линии, как показано, показывает в среднем 151 сперматозоид в каждой сперматеке. После освоения этот анализ может быть завершен за 10 минут для каждой зародышевой линии. При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что параметры анализа должны быть определены в соответствии с увеличением объектива, используемого для визуализации зародышевой линии в вашем эксперименте.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять автоматический анализ зародышевой линии, изучать структуру цитоскелета и подсчитывать количество ядер внутри зародышевой линии.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен автоматизированный метод для трехмерной реконструкции зародышевой линии Caenorhabditis elegans с акцентом на анализ ядер, распределения белков и структуры цитоскелета. Метод направлен на повышение эффективности и точности анализа зародышевой линии.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Эмбриология
Предыстория
- Понимание структуры зародышевой линии C. elegans имеет решающее значение для эмбриологических исследований.
- Ручной анализ образцов зародышевой линии занимает много времени и склонен к ошибкам.
- Автоматизированные методы могут упростить этот процесс.
- Предыдущие методы были неэффективны при анализе большого количества образцов.
Цель исследования
- Автоматизировать анализ зародышевой линии C. elegans.
- Точно определить количество и положение ядер.
- Анализировать распределение белков и структуру цитоскелета.
Используемые методы
- Образцы окрашиваются и размещаются на слайдах для исследования.
- Слайды размещаются над объективом с увеличением 63X конфокального микроскопа.
- Зародышевая линия локализуется и помечается с помощью конфокального программного обеспечения.
- Толщина зародышевой линии определяется и разрезается на секции по 0,5 микрометра.
Основные результаты
- Метод значительно сокращает время анализа.
- Увеличивает объем анализируемых образцов.
- Сводится к минимуму ошибка, связанная с ручным анализом.
- Достигается точное отображение ядер и распределение белков.
Выводы
- Этот автоматизированный метод улучшает исследование зародышевой линии C. elegans.
- Он предоставляет надежный подход для анализа сложных биологических структур.
- Техника может способствовать будущим исследованиям в области эмбриологии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Automated three-dimensional analysis of the C. elegans germline enables high-throughput phenotypic screening for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By quantifying nuclei distribution, protein localization, and cytoskeletal architecture, the method supports predictive confidence in genetic and pharmacological interventions. This approach reduces manual variability and increases reproducibility, facilitating scalable assay development for disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative mapping of nuclear positioning and protein expression patterns.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible readouts of germline architecture across genetic backgrounds.
- Predictive Value: Enhances target validation by correlating cytoskeletal changes with developmental phenotypes, aiding in lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs for nuclei count, sperm number, and cytoskeletal structure to enable reliable compound screening.
- Operational Value: Increases assay throughput and reproducibility through automated image acquisition and analysis, reducing manual bias.
- Scalability: Facilitates preparation of validated germline models for downstream workflows in phenotypic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables disease-relevant system modeling by linking germline structural changes to functional outcomes in stem cell development and apoptosis.
- Mechanistic De-risking: Provides insight into spatial developmental requirements through cytoskeletal architecture analysis, supporting preclinical model refinement.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by delivering consistent, threshold-based phenotypic readouts across experimental conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment by delivering standardized, quantifiable germline phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling 3D visualization of nuclear and protein distribution in distinct germline regions.
- Screening: Delivers assay readiness through automated, reproducible quantification of nuclei and sperm, enabling reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates statistical outputs such as nuclear density and cytoskeletal architecture metrics that allow cross-condition comparison and hit selection.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by linking germline structural phenotypes to stem cell dynamics and meiotic progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform applicable across multiple genetic backgrounds and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through objective, 3D-based quantification of germline architecture, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability by minimizing human error and enabling rapid analysis (10 minutes per germline).
- Strategic Value: Improves capital efficiency by increasing sample size and accelerating go/no-go decisions in target validation pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing reproducible phenotypic data for lead compound evaluation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and 3D image analysis software for accurate germline segmentation and threshold setting.
- Dependent on access to a confocal microscope with 63X objective and fluorescent staining capabilities for DAPI, phalloidin, and protein targets.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition parameters (slice thickness, averaging, background subtraction) to ensure reproducibility.
- Requires adaptation of region-of-interest definitions and spot function parameters when applied to different genetic backgrounds or staining protocols.
- Practical limitations include the need for optimized staining and mounting protocols to preserve germline structure for accurate 3D reconstruction.
