Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет
19 апреля 2018 г.
Мы представляем автоматизированный метод для трехмерной реконструкции Caenorhabditis elegans микрофлорой. Наш метод определяет количество и положение каждого ядра в микрофлорой и анализ распределения белка микрофлорой и цитоскелета структуру.
Общая цель этого метода заключается в автоматизации анализа зародышевой линии Caenorhabditis elegans для изучения ее ядер, белка и распределения цитоскелета. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области C.Elegans о количестве ядер и сперматозоидов, распределении ядра и цитоскелетной структуре зародышевой линии. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он сокращает время анализа, увеличивает размер выборки и исключает человеческую ошибку, связанную с ручным анализом.
Чтобы получить изображение образцов, поместите предметные стекла с окрашенными зародышевыми линиями в держатель предметного стекла над 63-кратным объективом конфокального микроскопа и найдите зародышевую линию. Сфокусируйтесь на верхней части зародышевой линии и отметьте ее с помощью программного обеспечения для конфокального микроскопа. Когда общая толщина зародышевой линии будет определена, определите толщину каждого среза с точностью до 0,5 микрометра и отметьте всю зародышевую линию.
Затем начните сбор данных, сканируя каждый срез восемь раз и усредняя значения для улучшения качества изображения. Когда все изображения будут получены, импортируйте изображения в соответствующую программу для анализа изображений и используйте инструмент функции поверхности для выбора митотической области. Появится изображение дистального конца зародышевой линии.
Отмените работу мастера автоматического создания поверхности и вручную нарисуйте интересующую область вокруг митотической области на первом и последнем срезах изображения из трехмерной стопки. Нажмите кнопку "Создать поверхность", а затем команду "Канал маски", чтобы замаскировать все каналы, кроме канала DAPI. С помощью инструмента функции spot определите параметры размера митотической области с диаметром XY два микрометра и неопределенным диаметром Z.
Нажмите «Вычесть фон», чтобы вычесть фон. Чтобы определить минимальное пороговое значение, увеличьте минимальный порог 3D-рендеринга на зародышевой линии, окрашенной DAPI, до тех пор, пока первое пятно не появится за пределами зародышевой линии, и создайте 3D-модель для каждой области. После сохранения изображений нажмите на таблицу, чтобы просмотреть количество ядер, автоматически сгенерированных программным обеспечением, и экспортируйте изображения в виде файлов TIFF.
Для переходной зоны создайте поверхность, как описано ранее. Затем нажмите кнопку «Маскировать канал», чтобы замаскировать все каналы, кроме канала DAPI. Используя функцию Spot, определите диаметр XY в два микрометра и диаметр Z в 1,5 микрометра и нажмите кнопку Вычесть фон, чтобы вычесть фон.
Чтобы определить минимальное пороговое значение, увеличьте минимальный порог 3D-рендеринга на зародышевой линии, окрашенной DAPI, до тех пор, пока первое пятно не появится за пределами зародышевой линии, и создайте 3D-модель для каждой области. После сохранения изображений нажмите на таблицу, чтобы просмотреть количество ядер, автоматически сгенерированных программным обеспечением, и экспортируйте изображения в виде файлов TIFF. Для оценки числа сперматозоидов выберите сперматеку в качестве области интереса, как показано для областей ядер, и используйте инструмент функции пятна для определения диаметра XY от 0,75 до одного микрометра с неопределенным диаметром Z для обнаружения каждого сперматозоида.
Выберите поле Вычесть фон и используйте значения коррекции фона, рассчитанные программным обеспечением, для вычитания фона. Затем настройте порог 3D-рендеринга, чтобы обнаружить все сперматозоиды, окрашенные DAPI, в сперматеке. Для подсчета хромосом в ооцитах выберите ооциты и определите диаметр XY как менее 0,75 микрометра, а также определите порог перед разработкой 3D-моделей.
Затем сохраните изображения для экспорта в виде файлов TIFF. Для реконструкции зародышевой линии цитоскелета определите интересующую митотическую область в зародышевой линии и создайте поверхностную маску, как было показано ранее. Щелкните Маскировать каналы, чтобы замаскировать все каналы, кроме канала фаллоидина, и используйте инструмент функции поверхности для определения детализации поверхности размером 0,25 микрометра.
После вычитания фона отрегулируйте порог 3D-рендеринга, чтобы сохранить разработанное 3D-изображение для экспорта в виде файла TIFF. Распределение ядер зависит от стадии дифференцировки. Например, в митотической области внутренний актин выглядит как твердая масса, на которой организованы ядра.
В зародышевой линии дикого типа митотическая область содержит примерно 250 ядер и плотно упакована ядрами по сравнению с остальной частью зародышевой линии. Однако по мере удаления ядер от дистального конца они кажутся ближе к окружности зародышевой линии, при этом изменение распределения начинается в переходной зоне и заканчивается, когда ядра вступают в третью стадию профазы в мейозе. В переходной зоне внутренний актин зародышевой линии принимает более цилиндрическую структуру, становясь полым цилиндром по мере достижения пахитена.
Второй слой актина покрывает внутренний слой, придавая форму зародышевой линии. Этот цилиндр в структуре актина цилиндра исчезает по направлению к области ооцита, и в этот момент актин проявляется в виде толстых волокон, покрывающих ооциты. В сперматеке актин также образует толстые пучки волокон, хотя эти волокна, по-видимому, упакованы друг к другу более плотно, чем в области ооцитов.
Трехмерная визуализация проксимального конца зародышевой линии, как показано, показывает в среднем 151 сперматозоид в каждой сперматеке. После освоения этот анализ может быть завершен за 10 минут для каждой зародышевой линии. При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что параметры анализа должны быть определены в соответствии с увеличением объектива, используемого для визуализации зародышевой линии в вашем эксперименте.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять автоматический анализ зародышевой линии, изучать структуру цитоскелета и подсчитывать количество ядер внутри зародышевой линии.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен автоматизированный метод трехмерной реконструкции зародышевой линии Caenorhabditis elegans, ориентированный на анализ ядер, распределения белков и структуры цитоскелета. Целью метода является повышение эффективности и точности анализа зародышевой линии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Биология развития
Теоретическая часть
- Понимание структуры зародышевой линии C. elegans имеет решающее значение для исследований развития.
- Ручной анализ образцов зародышевой линии занимает много времени и подвержен ошибкам.
- Автоматизированные методы позволяют оптимизировать этот процесс.
- Предыдущие методики были недостаточно эффективны при анализе больших выборок образцов.
Цель исследования
- Для автоматизации анализа зародышевой линии C. elegans.
- Для точного определения количества и положения ядер.
- Для анализа распределения белков и структуры цитоскелета.
Используемые методы
- Образцы окрашивают и помещают на предметные стекла для получения изображений.
- Предметные стекла устанавливают над объективом 63X конфокального микроскопа.
- Положение зародышевой линии определяют и помечают с помощью программного обеспечения для конфокальной микроскопии.
- Определяют толщину зародышевой линии и разделяют ее на срезы толщиной 0.5 micrometer.
Основные результаты
- Данный метод значительно сокращает время анализа.
- Он позволяет увеличить объем анализируемых образцов.
- Минимизируется влияние человеческого фактора, связанного с ручным анализом.
- Достигается точное картирование ядер и распределения белков.
Выводы
- Этот автоматизированный метод расширяет возможности изучения зародышевой линии C. elegans.
- Он представляет собой надежный подход к анализу сложных биологических структур.
- Данная методика может способствовать дальнейшим исследованиям в области биологии развития.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Автоматизированный трехмерный анализ зародышевой линии C. elegans обеспечивает высокопроизводительный фенотипический скрининг для валидации мишеней и снижения механистических рисков на ранних этапах поиска лекарственных средств. Количественная оценка распределения ядер, локализации белков и архитектуры цитоскелета позволяет с высокой степенью достоверности прогнозировать результаты генетических и фармакологических вмешательств. Данный подход снижает влияние человеческого фактора и повышает воспроизводимость, способствуя разработке масштабируемых методов анализа для систем, имеющих значение для изучения заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством количественного картирования позиционирования ядер и паттернов экспрессии белков.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков, обеспечивая воспроизводимые показатели архитектуры зародышевой линии для различных генетических фонов.
- Прогностическая ценность: улучшает валидацию мишеней за счет корреляции изменений цитоскелета с фенотипами развития, что помогает в идентификации перспективных соединений-лидеров.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать стандартизированные количественные данные о количестве ядер, числе сперматозоидов и структуре цитоскелета для обеспечения надежного скрининга соединений.
- Практическая ценность: Повышает пропускную способность и воспроизводимость анализа за счет автоматизированного сбора и анализа изображений, что снижает влияние субъективного фактора.
- Масштабируемость: Облегчает подготовку валидированных моделей зародышевой линии для последующих этапов рабочих процессов в рамках кампаний по фенотипическому скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает моделирование систем, релевантных для заболевания, путем установления связи между структурными изменениями в зародышевой линии и функциональными результатами в процессах развития стволовых клеток и апоптоза.
- Механистическое снижение рисков: позволяет понять пространственные требования к развитию посредством анализа архитектуры цитоскелета, что способствует совершенствованию доклинических моделей.
- Прогресс с учетом рисков: поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) за счет получения согласованных фенотипических показателей на основе пороговых значений в различных экспериментальных условиях.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в общий процесс поиска и разработки — от ранней валидации мишени и идентификации соединений-лидеров до доклинической оценки — обеспечивая получение стандартизированных и количественно определяемых фенотипов зародышевой линии.
- Поисковая биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей за счет обеспечения 3D-визуализации распределения ядер и белков в различных областях зародышевой линии.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет автоматизированного, воспроизводимого количественного определения ядер и сперматозоидов, что позволяет проводить надежную оценку соединений.
- Аналитика: генерирует статистические данные, такие как показатели плотности ядер и архитектуры цитоскелета, что позволяет проводить сравнение между условиями и отбор хитов.
- Трансляционные исследования: связывает результаты поисковых исследований с доклиническим этапом, соотнося структурные фенотипы зародышевой линии с динамикой стволовых клеток и прогрессированием мейоза.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для визуализации и анализа, применимую для различных генетических фонов и экспериментальных парадигм.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозов за счет объективной 3D-квантификации архитектуры зародышевой линии, что снижает механистическую неопределенность.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и масштабируемость путем минимизации человеческих ошибок и обеспечения возможности быстрого анализа (10 минут на одну зародышевую линию).
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет увеличения объема выборки и ускорения принятия решений «go/no-go» в процессах валидации мишеней.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию с учетом рисков за счет предоставления воспроизводимых фенотипических данных для оценки ведущих соединений.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с конфокальной микроскопией и программным обеспечением для 3D-анализа изображений для точной сегментации зародышевой линии и установки пороговых значений.
- Зависимость от наличия конфокального микроскопа с объективом 63X и возможностью флуоресцентного окрашивания DAPI, фаллоидином и белками-мишенями.
- Необходима межгрупповая стандартизация параметров получения изображений (толщина среза, усреднение, вычитание фона) для обеспечения воспроизводимости.
- Требуется адаптация определений областей интереса (ROI) и параметров функции выделения пятен (spot function) при применении к разным генетическим фонам или протоколам окрашивания.
- Практические ограничения включают необходимость оптимизации протоколов окрашивания и монтирования для сохранения структуры зародышевой линии для точной 3D-реконструкции.
