Подход, основанный на капельки Microfluidic и микросферы ПЦР-амплификации для одноцепочечной ДНК ампликонов

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в комбинаторной технике микрофлюидной системы и молекулярной биотехнологической области, таких как микрофлюидные устройства и асимметричный метод ПЦР. Основными преимуществами этой техники являются эффективное генерация высоко гомогенизированных микросфер и выработка одноявленной ДНК без каких-либо дополнительных шагов разделения. Последствия этого метода распространяются на диагностику или терапию различных заболеваний.

Поскольку генерация однонитной ДНК является ключом к анализу ap-ta-mo-sis, она может быть использована для обнаружения и лечения. Хотя этот метод может дать представление о трехмерной микрофлюидной системе в MEMS, он также может быть применен к другим системам, используемым для обнаружения и лечения заболеваний. Как правило, лица, новые для этого метода будет бороться, чтобы должным образом контролировать жидкости из течет в обратном направлении.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для наблюдения за образованием микросферы в геометрии, фокусировкой потока и затвердевание генерируемых микросфер. Во-первых, подготовить 20 миллилитров жидкого PDMS пре-полимера путем смешивания базового полимера и катализатора в соотношении 10 к одному. Налейте 10 миллилитров жидкой PDMS на подготовленную форму СУ-8 на кремниевой пластине для верхней части микрофлюидной сети.

Для нижней плоской части, залить тот же объем жидкости PDMS на кремниевой пластины без формы структуры. Поместите две кремниевые пластины, покрытые жидким PDMS предварительно полимера на разогретой плите и вылечить при 75 градусов по Цельсию в течение 30 минут. После этого вручную снимите вылеченный слой PDMS с формы СУ-8.

Выровнять 1,5 миллиметра диаметром круглое отверстие штамповки инструмент для нефтяного порта на реплицированных микрофлюидной сети для межфакторных микрон-масштаба каналов потока с макро-жидкости образцов. Затем вручную пробить через отверстие. После повторения процесса штамповки три раза, выполнить гидрофильные обработки поверхности как на верхних и нижних слоев PDMS с помощью портативного лечения короны в течение нескольких секунд на образец.

Стек двух плазменных слоев PDMS и тепла при температуре 90 градусов по Цельсию в течение 30 минут на плите для ПРОЦЕССА связи PDMS-к-PDMS. Vortex и кратко центрифуга стандартный однолистный ДНК акридит помечены зонд и 19-к-одному акриламид бис фондовый раствор. Подготовь решение одно, смешивая 25 микролитров раствора 40%акриламидных бисов, 10 микролитров однопутной ДНК, 10 микролитров буфера 5X TBE и пять микролитров воды.

Приготовьте раствор два с 50 микролитров 20%аммония persulfate. Подготовь два шприца, индивидуально заполненные раствором один и два раствора, и смонтировать их на шприц-насос, чтобы внедрить раствор, вливый в микрофлюидную платформу. Подготовка минерального масла, смешанного с 0,4%TEMED для поверхностной затвердевания микросферы.

После заполнения стеклянной бутылки с минеральным маслом, вставьте две трубки в пневматические и жидкие порты в крышке стеклянной бутылки в качестве микрофлюидного резервуара. Соедините трубки между стеклянной бутылкой и масляным портом в микрофлюидном устройстве. Подключите трубки к двум портам раствора в микрофлюидных устройствах, чтобы поставлять два раствора из шприц-насосов.

Затем вставьте трубки в выходной порт для переноса генерируемой микросферы в стакан. Затем установите скорость потока шприц-насоса до 0,4-0,7 миллилитров в час. Отрегулируйте давление сжатого воздуха компрессора с помощью регулятора.

Поместите стеклянный стакан с магнитной панелью перемешать на hotplate и установить скорость вращения. Работайте шприц-насосом и поставь сжатый воздух, генерируемый внешним компрессором, в стеклянную бутылку с помощью выключенного управления электромагнитным клапаном. Используя цифровой микроскоп, наблюдайте за образованием микросфер в геометрии, фокусировкой потока и затвердевание генерируемых микросфер в стеклянном стакане.

Наблюдение за образованием микросфер является одним из наиболее важных шагов, поскольку это основной процесс в данном исследовании для производства микросфер и микрофлюидной системы. После этого перенесите 100 микролитров микросфер в 1,5 миллилитровую микро центрифугу. Затем удалите супернатант через нежные центрифугирования и трубопроводов.

Повторное использование бесплатного зонда-модифицированного цианина-3 с использованием 100 микролитров буфера 1X TE для достижения окончательной концентрации 100 микромолей. Далее добавьте 100 микромолей дополнительного зонда-модифицированного цианина-3 к стерильной микро центрифуге на 1,5 миллилитра, содержащей кополимерные микросферы AP. Нажмите трубку несколько раз, чтобы смешать и инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение одного часа.

После инкубации отбросьте супернатант и удалите остаточный буфер через трубу. Затем трижды промыть 500 микролитров буфера TE. Поместите микросферы на стеклянную горку 75 на 50 миллиметров и накройте алюминиевой фольгой перед визуализацией.

Получить около 25 микросфер с помощью микроскопического подсчета с помощью светового микроскопа с 40X увеличение. После этого объедините все реагенты, описанные в текстовом протоколе. Поместите образцы в термоциклер и запустите асимметричный ПЦР при соответствующих условиях.

Сбор супернатанта после асимметричного ПЦР является одним из наиболее важных этапов, поскольку он является основным процессом генерации однотяговой ДНК с микросферой. После усиления добавьте восемь микролитров буфера загрузки 6X в каждый образец. Загрузите 15 микролитров каждого образца в 2%agarose гель.

Затем выполняте электрофорез на 100 вольт в течение 35 минут в буфере 1X TAE. Поместите гибридизированные микросферы в держатель и прикрепите держатель к стадии конфокального микроскопа. Выберите лазер и включите его в лазерном управлении.

Выберите объектив цели в управлении микроскопом. Затем выберите нужный фильтр для цианина-3 и канал в управлении конфигурацией. Наконец, начните эксперимент и наблюдайте за образцом.

Изготовленная полимерная капельная микрофлюидная платформа состоит из двух слоев PDMS. Для генерации микросфер используются три вида микрофлюидных сетей, которые являются геометрией, фокусирующей поток, серпантинным каналом для смешивания решений один и два, и каналом полимеризации для микросферной затвердевания. Для генерации микросфер в микрофлюидной платформе использовалась лабораторная пневматическая система контроля непрерывного потока минерального масла и два шприц-насоса для потока раствора.

Если микросферы правильно функционируют с помощью пяти-премьер-акридитного ДНК-зонда, они должны привести к охвату флуоресцентной активности на поверхности во время эксперимента по гибридизации, как показано на этих флуоресцентных изображениях. Если кополимеризация происходит неправильно, оптическое изображение микросферы будет проявлять внутреннее загрязнение внутри микросфер. Манипулирование 3D-поверхностью микросфер с помощью олиго-зонда ДНК является гораздо более быстрым процессом, и платформа синтеза микросферы на потоке может стать инструментом для однопутного усиления и очистки ДНК.

Первоначально copolymerized пять премьер AP обеспечивает три премьер гидроксила конец для полимеризации ДНК после annealing к его дополнительным шаблоном. В асимметричном эксперименте ПЦР наблюдались двойные загрязняющие вещества ДНК. Полученная однострувочная ДНК, накопленная из микросферного ПЦР, была продемонстрирована по сравнению с маркерами синтетического размера с помощью анализа электрофореза геля.

При попытке этой процедуры, важно помнить, что предварительное знание протоколов и корректировок, которые обычно необходимы для оптимизации экспериментов ПЦР, необходимы для получения цикла усиления, температуры аннеаля и последовательности зонда в этом методе. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области диагностики и терапии для подключения двух регионов в молекулярной биотехнологии и биомедицины. Не забывайте, что работа с раствором акриламида может быть опасной и такие меры предосторожности, как ношение перчаток и лабораторных пальто всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.