Делая спряжение индуцированной флуоресцентные Пегилированный вирус типа частиц по химии Dibromomaleimide дисульфида

Общая цель данного метода биоконъюгации заключается в флуоресцентной функционализации вирусоподобных частиц, содержащих дисульфидные связи. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о реакциях биоконъюгации для вирусоподобных частиц, которые имеют ограниченное количество аминокислотных остатков, пригодных для функционализации. Основное преимущество данного метода заключается в том, что в ходе одной реакции можно одновременно ввести новые функциональные группы и сформировать индуцированные конъюгацией флуорофоры. Мы полагаем, что помимо Q-Beta, данная реакция может быть применена к любым вирусоподобным частицам, имеющим дисульфидные связи.

Перед началом процедуры экспрессии бактериофага Q-Beta протрите рабочую поверхность раствором гипохлорита натрия и этанола в соотношении 1:1. В асептических условиях приготовьте две стартовые культуры объемом по 3 мл, перенеся одиночные колонии E.coli BL21 в среду SOB. Инкубируйте культуры при температуре 37 °C и относительной влажности 0% в течение ночи при перемешивании со скоростью 250 rpm. На следующий день извлеките обе стартовые культуры объемом 3 мл из шейкера и в асептических условиях перелейте каждую из них в двухлитровую коническую колбу с отражателями (баффл-колбу), содержащую 1 л свежей среды SOB. Поместите две колбы с инокулированной средой на шейкер при 250 rpm в помещение с температурой 37 °C и относительной влажностью 0%. Культивируйте бактерии до достижения оптической плотности при 600 нм (OD 600) от 0,9 до 1,0. Обычно это занимает около пяти часов. Когда культуры достигнут требуемого значения OD 600, с помощью дозатора P1000 добавьте в каждую колбу 1 мл 1-молярного IPTG для индукции экспрессии белка. Оставьте колбы на шейкере в теплом помещении на ночь.

На следующее утро извлеките колбы из шейкера, перенесите содержимое каждой колбы в одномллитровый флакон и центрифугируйте при 20 621 ×g при температуре 4 °C в течение одного часа для сбора клеток. По завершении центрифугирования удалите супернатант, слив его в колбу с примерно 5 мл отбеливателя для уничтожения бактерий.

Чтобы собрать клеточный осадок, с помощью шпателя соскребите его со дна центрифужной бутыли и перенесите в центрифужную пробирку объемом 50 мл.

Для начала процедуры очистки Q-Beta ресуспендируйте каждый осадок клеток в 20–30 миллилитрах 0,1-молярного калий-фосфатного буфера (pH 7). Убедитесь, что в суспензии нет комочков. Проведите лизис клеток с помощью микрофлюидизатора согласно протоколу производителя. Повторите лизис клеток не менее двух раз для увеличения выхода частиц. Перенесите лизаты в центрифужные флаконы объемом 250 миллилитров и центрифугируйте при 20 621 ×g при температуре 4 °C в течение одного часа. Измерьте объем супернатанта в миллилитрах. Умножьте полученное значение на 0,265 и добавьте к супернатанту соответствующее количество сульфата аммония в граммах. Добавьте магнитный якорь и перемешивайте на магнитной мешалке при 200 об/мин при температуре 4 °C в течение как минимум одного часа для осаждения белка. Центрифугируйте в флаконах объемом 250 миллилитров при 20 621 ×g при температуре 4 °C в течение одного часа. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок примерно в 40 миллилитрах 0,1-молярного калий-фосфатного буфера (pH 7). Добавьте к неочищенному образцу равный объем смеси хлороформа и н-бутанола (1:1) и перемешайте с помощью вортекса в течение нескольких секунд. Перенесите смесь в пробирку объемом 38 миллилитров. Центрифугируйте при 20 621 ×g при температуре 4 °C в течение 30 минут. С помощью пипетки соберите верхний водный слой. Будьте осторожны, чтобы не захватить гельподобный слой, образовавшийся между водным и органическим слоями.

Затем разморозьте от 40% до 65% заранее приготовленные градиенты сахарозы. Нанесите примерно два миллилитра экстракта на каждый градиент.

Центрифугируйте в ультрацентрифуге при 99 582 ×g при температуре 4 °C в течение 16 часов со свободным замедлением. По завершении ультрацентрифугирования подсветите каждую пробирку светодиодным фонариком, чтобы подтвердить наличие видимой синей полосы. Для сбора этих частиц используйте шприц с длинной иглой. Осадите частицы в ультрацентрифуге при 370 541 ×g при температуре 4 °C в течение 2,5 часов. Полученный осадок очищенных частиц должен быть прозрачным. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 0,1-молярном калий-фосфатном буфере, pH 7.

На данной схеме показан процесс конъюгации, который будет продемонстрирован. Для восстановления всех дисульфидных связей с целью получения восстановленных капсидов Q-Beta при комнатной температуре в течение одного часа используют 10 эквивалентов трис(2-карбоксиэтил)фосфина или TCEP относительно дисульфидов в одном миллиграмме Q-Beta. Непосредственно перед восстановлением дисульфидных связей в Q-Beta приготовьте свежий раствор TCEP.

Растворите 0,002 г TCEP в 1 мл ультрачистой воды для приготовления 100-кратного стокового раствора. Добавьте 200 µL Q-Beta в концентрации 5 мг/мл в пробирку для микроцентрифуги. Затем добавьте в пробирку 20 µL 100-кратного стокового раствора TCEP. Инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа.

Тем временем подготовьте раствор диброммалеинимид-полиэтиленгликоля (DB-PEG) для последующей реакции повторного связывания восстановленных дисульфидов. Растворите 0,0017 г DB-PEG в 100 µL диметилформамида. Добавьте 680 µL 10-мМ раствора фосфата натрия, pH 5. Затем добавьте восстановленный Q-Beta в раствор DB-PEG и наблюдайте за процессом смешивания с помощью ручного УФ-фонаря с длиной волны 365 нм. После смешивания должна сразу появиться ярко-желтая флуоресценция. Оставьте реакционную смесь при комнатной температуре на ротаторе на ночь.

На следующее утро очистите реакционную смесь с помощью центрифужного фильтра, используя 1X PBS, при 3 283 ×g и температуре 4 °C в течение 20 минут. В завершение проконтролируйте конъюгацию с помощью невосстанавливающего SDS-полиакриламидного гель-электрофореза и электрофореза в нативном агарозном геле.

Конъюгация DB-PEG с Q-Beta была подтверждена методом невосстанавливающего электрофореза в полиакриламидном геле с SDS с последующим окрашиванием УФ-светом и кумасси синим. Все флуоресцентные полосы совпали с полосами, окрашенными кумасси синим, что свидетельствует об успешной конъюгации. Целостность конъюгатов Q-Beta-PEG была подтверждена методом электрофореза в нативном агарозном геле и просвечивающей электронной микроскопией.

На верхней микрофотографии показаны Q-Beta-малеимид (Q-Beta-M), а на нижней — Q-Beta-PEG. Флуоресцентная спектроскопия Q-Beta-M и Q-Beta-PEG в 0,1 молярном калий-фосфатном буфере выявила максимум возбуждения около 400 нанометров и максимум эмиссии в диапазоне от 540 до 550 нанометров. При инкубации Q-Beta-PEG с клетками макрофагов мыши в бессывороточной среде DMEM с последующим окрашиванием ядер изображения колокализации показывают, что желтофлуоресцентные частицы поглощались клетками, и их можно отслеживать через четыре часа инкубации.

Напротив, нефункционализированные вирусоподобные частицы Q-Beta демонстрируют незначительную флуоресценцию.

Данный протокол поможет исследователям очистить Q-Beta за четыре дня и провести конъюгационную реакцию повторного связывания в течение ночи. При выполнении этой процедуры важно помнить, что конъюгационная реакция протекает наиболее эффективно в кислых условиях, например при pH 5.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как очищать VLP Q-бета и восстанавливать дисульфидные связи с помощью диброммалеинимидных соединений для создания флуоресцентно-меченых VLP. После своей разработки эта методика предоставила исследователям дополнительную функциональную группу, которая может быть использована для двойной функционализации внешней поверхности бактериофага Q-бета.