Изоляция, характеристики и высокую пропускную способность внеклеточного Flux анализ мышь первичной почечной трубчатых эпителиальных клеток

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о почечном метаболизме, таких как окисление жирных кислот, которое тесно связано с развитием почечного фиброза и различных других нефропатий. Основным преимуществом этой методики является использование высокопроизводительной платформы для скрининга соединений, регулирующих биоэнергетику митохондрий в эпителиальных клетках почечных канальцев. Применение этого метода распространяется на терапию метаболических заболеваний почек, поскольку он позволяет проводить скрининг соединений, регулирующих метаболизм митохондрий в эпителиальных клетках почек.

Чтобы приготовить покрытые коллагеном 60-миллиметровые чашки Петри, добавьте в каждое блюдо два миллилитра предварительно отфильтрованной 20-миллимолярной уксусной кислоты с последующим добавлением 35 микролитров раствора коллагена I. Затем выдержите пластину при комнатной температуре в течение часа, высушите на воздухе и подвергните воздействию ультрафиолета. Далее смойте остатки уксусной кислоты с помощью PBS. Выполните три полоскания.

Затем храните чашку в инкубаторе для клеточных культур без углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия. После подготовки мыши к операции удалите шерсть с груди и живота с помощью крема для депиляции. Затем продезинфицируйте кожу йодом, и сотрите остатки йода.

Далее сделайте разрез, чтобы открыть брюшную полость, и обнажить сердце и почки. Теперь установите перфузионный насос на 32 миллилитра в минуту и удалите все пузырьки в трубке перед началом перфузии. Используйте иглу 27 калибра в конце лески.

Чтобы продолжить, введите иглу в левый желудочек через верхушку сердца. Как только буфер заполнит сердце, проделайте отверстие в правом предсердии, чтобы создать выход для перфузионного буфера. Затем переключитесь на буфер для разложения и немного уменьшите скорость насоса до 30 миллилитров в минуту для разложения.

После того, как будет перфузировано 20 миллилитров буфера для пищеварения, удалите обе почки для выделения канальцевых клеток. Чтобы обработать собранные почки, сначала удалите почечные капсулы и мозговое вещество. Затем измельчите обе почки на крошечные кусочки и инкубируйте их в 10 миллилитрах буфера для пищеварения в духовке при температуре 37 градусов Цельсия при осторожном вращении в течение пяти минут.

После переваривания удалите все непереваренные ткани, пропустив буфер через фильтр 70 микрон. После сбора переваренной ткани добавьте 10 миллилитров питательной среды, чтобы остановить пищеварение. Далее центрифугируйте отфильтрованную тканевую суспензию при 50 г в течение пяти минут для гранулирования трубчатых клеток.

Затем перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку, добавьте пять миллилитров питательной среды и повторите центрифугирование, чтобы собрать все оставшиеся трубчатые клетки. Теперь суспендируйте первую гранулу в 20 миллилитрах питательной среды, и центрифугируйте ее при 50 г в течение пяти минут для дальнейшей очистки собранных клеток. Утилизируйте надосадочную жидкость.

Затем ресуспендируйте обе гранулы в 10 миллилитрах питательной среды. Далее подсчитайте живые клетки с помощью окрашивания трипановым синим. Затем посадите до 10 миллионов клеток на 60-миллиметровую чашку, покрытую коллагеном, и дайте трубчатым клеткам прикрепиться на ночь.

Для начала засейте трубчатые клетки P1 в 40 000 клеток в лунки свежеприготовленной 96-луночной микропластины, покрытой коллагеном. Используйте 100 микролитров питательных сред на лунку. Оптимизация плотности клеток и концентрации соединений в анализе внеклеточного потока является ключом к успешному эксперименту.

Мы рекомендуем провести пилотный эксперимент по титрованию для определения оптимальной плотности клеток и концентрации соединений. Далее увлажните картридж датчика. Сначала поднимите картридж датчика и заполните каждую лунку пластины 200 микролитрами калибровочного раствора.

Затем переместите картридж, чтобы погрузить датчики, и инкубируйте сборку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день отсадите старую среду и замените ее 175 микролитрами среды для анализа глюкозы или жирных кислот. Затем продолжайте инкубацию в течение часа без углекислого газа.

Во время инкубации клеток загрузите порт А картриджа 25 микролитрами олигомицина, порт B — FCCP, порт C — ротеноном/антимицином A, а порт D и все остальные порты — водой. Теперь храните картридж в инкубаторе без углекислого газа до тех пор, пока установка не будет готова к калибровке. Включите анализатор внеклеточного потока и контроллер.

Затем откройте программу «Анализатор», выберите стандартный анализ и нажмите опцию «Мастер анализа». Затем на вкладке Соединения назначьте соединения соответствующим портам. На вкладке Коррекция фона выберите скважины, которые не содержат ячеек.

Затем используйте вкладку Группы и метки, чтобы пометить экспериментальные группы. Затем на вкладке «Протокол» установите соответствующие циклы смешивания и измерения с помощью доступных команд. Эти настройки указываются в текстовом протоколе, и как только они будут введены, сохраняйте шаблон для дальнейшего использования.

Теперь нажмите End Wizard, чтобы продолжить. Теперь нажмите кнопку Пуск, чтобы начать калибровку. Затем анализатор извлекает держатель пластины и предлагает вставить пластину картриджа.

Этот процесс калибровки занимает от 20 до 25 минут. После калибровки системы нажмите команду prompt, чтобы заменить калибровочную пластину на пластину ячейки, и продолжите запуск. Когда прогон будет завершен, сохраните данные OCR и извлеките пластину из анализатора.

Теперь добавьте Hoechst в каждую из пробирных лунок и инкубируйте планшет в течение пяти минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Затем подсчитайте ячейки, используя 355-нанометровое возбуждение и 460-нанометровое излучение, и нормализуйте данные OCR до количества клеток. В этом протоколе гетерогенная популяция клеток почек, не полностью переваренных канальцев и других тканевых остатков культивировалась на пластинах, покрытых коллагеном.

На следующий день после выделения питательную среду центрифугировали для удаления мусора, а трубчатые клетки повторно пластинировали. Впоследствии клетки прикреплялись легче, и к пятому дню в культуре они были на уровне от 80 до 90% конфлюенции. Затем почечные ТЭО были субкультивированы и выросли до слияния в течение одной недели.

Аналогичный рост наблюдался и в следующих двух отрывках. Монослой ячеек принял куполообразную форму, оторвавшись от пластины и оставаясь прикрепленным плотными соединениями. Митохондриальное дыхание изолированных первичных ТЭО измеряли с помощью описанного анализа внеклеточного потока OCR при различных плотностях покрытия, как описано.

40 000 ячеек на лунку покрывали поверхность пластины лучше, чем любые другие плотности покрытия, что делало ее оптимальной концентрацией для тестирования взаимодействий между клетками и соединениями. Например, среды, содержащие субстрат жирных кислот, наносили на ТЭО вместе с 2DG, ингибитором гликолиза, для непосредственной оценки окисления жирных кислот в ТЭО в первом и втором пассажах.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно всегда вести учет точных объемов и концентраций в каждой скважине. Изменения в конечных концентрациях компонентов могут привести к провалу всего эксперимента. После его разработки этот метод проложит путь исследователям в области нефрологии к изучению роли метаболизма канальцевых жирных кислот в патогенезе различных нефропатий.