2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Этот метод может быть использован не только для решения ключевых вопросов в фундаментальных исследованиях, но и внести вклад в медицинскую, фармацевтическую и биотехнологическую области, определяя новые низкомолекулярные лиганды незаменимых белков. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет проводить параллельный анализ белка и метаболических партнеров выбранного белка в условиях близких к реальным. Этот метод помогает вылавливать взаимодействующие молекулы, не ограничиваясь заранее выбранными лигандами.

Хотя этот метод был разработан для растений, он также может быть применен для других систем, таких как клетки HeLa, E.coli и S.Cerevisiae. Для начала приготовьте среду МСМО и отрегулируйте pH до 5,7 с помощью одного молярного гидроксида калия. Затем автоклавируйте раствор в течение 15 минут при температуре 121 градус Цельсия.

Добавляйте добавки в среду непосредственно перед началом эксперимента. Теперь выращивайте трансгенную культуру клеток PSBL Arabidopsis thaliana в 50 миллилитрах среды MSMO в 100-миллилитровой колбе. Затем поместите колбу на шейкер орбитальной платформы и осторожно взбалтывайте элементы со скоростью 130 об/мин при температуре 20 градусов Цельсия на свету.

Каждые семь дней субкультивируйте клетки в свежей среде в соотношении 1:10 раствора. Затем используйте стеклянную воронку с нейлоновой сеткой, установленную на конической колбе, соединенную с вакуумным насосом, чтобы собрать клетки во время логарифмической фазы роста. Затем, заверните высушенные ячейки в алюминиевую фольгу, и заморозьте в жидком азоте.

С помощью предварительно охлажденной смесительной мельницы, настроенной на частоту колебаний 20 Гц. Гомогенизируйте собранный и замороженный материал растительных клеток в мелкий порошок в течение двух минут. Далее выделяют три грамма измельченного порошка на пробу с помощью жидкого азота, предварительно охлаждая оборудование для предотвращения его оттаивания.

Затем с помощью жидкого азота, предварительно охлажденного раствора, растирают измельченный порошок с тремя миллилитрами ледяного буфера для лизиса до тех пор, пока он не оттает. Размороженный образец разделите сразу на две миллилитровые микроцентрифужные пробирки. Центрифугируйте образцы при температуре 20, 817 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия для удаления клеточного мусора.

Пока образец центрифугируется, на образец вносят 100 микролитров гранул сефарозы IgG. Добавьте один миллилитр буфера для лизиса и повторно суспензируйте бусины путем вортексирования. Вращайте вспышкой в течение трех секунд при 2 000 g и выбросьте буфер для лизиса.

Наконец, повторно суспендируйте шарики в 400 микролитрах буфера для лизиса. После центрифугирования перелейте три миллилитра прозрачного растительного лизата в коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. Добавьте предварительно уравновешенные шарики в растительный лизат и инкубируйте смесь на вращающемся колесе в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия.

Перелейте смесь в шприц, соединенный с крышкой, заблокированной приманкой, на спиновой колонке с фильтром размером пор 35 микрометров, расположенным в верхней части вакуумного коллектора. Пропустите лизат через агрегат, включив вакуумный насос с легким давлением, чтобы избежать повреждения бусин. Несвязанный лизат сливается в станцию отходов, расположенную в основании в коллекторе, а белковые комплексы, связанные с гранулами, остаются на фильтре.

Как только шприц опорожнится от лизата клеток, добавьте 10 миллилитров буфера для промывки, чтобы промыть бусины. Затем добавьте миллилитр элюирующего буфера, чтобы выполнить второй этап стирки. Теперь снимите шприц и крышку замка приманки.

Закройте нижнюю крышку на столбике и добавьте в бусины 400 микролитров элюирующего буфера, содержащего 50 единиц усиленной формы вируса травления табака, протеазы. Поместите колонку на настольный шейкер с частотой вращения 1 000 об/мин в течение 30 минут при температуре 16 градусов Цельсия. Затем добавьте в колонку еще 50 единиц протеазы, и инкубируйте смесь на шейкере, как на предыдущем этапе.

Далее снимите нижнюю крышку, и установите колонку на место в двухмиллилитровой микроцентрифужной пробирке. Центрифугируйте при температуре 20, 817 г в течение одной минуты, чтобы собрать элюат и приступить к экстракции белка и метаболитов. Чтобы начать экстракцию, добавьте в элюат один миллилитр метанолового растворителя метанола МТБЭ в соотношении три к одному.

Переверните пробирку, чтобы перемешать с образцом. Далее добавьте в смесь 0,4 миллилитра от одного до трех водных растворов метанола, и переверните пробирку, чтобы перемешать образец. Затем центрифугируйте образец при температуре 20 817 г в течение двух минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить разделение фаз.

С помощью одной миллилитровой пипетки для ручного обращения с жидкостью удалите верхнюю фазу, содержащую липиды. Затем добавьте 0,2 миллилитра метанола, и переверните пробирку, чтобы перемешать образец. Центрифугируйте при 20, 817 г в течение двух минут при комнатной температуре, и соберите полярную фазу в новую пробирку для измерения метаболитов.

Оставьте примерно 50 микролитров полярной фазы на дне пробирки, чтобы избежать смещения белковой гранулы. Затем высушите пробирку, содержащую полярную фазу, в центробежном испарителе на ночь. Высушите пробирки с протеиновыми гранулами в течение 30-60 минут, чтобы избежать пересушивания.

С помощью одноступенчатой аффинной очистки в сочетании с масс-спектрометрией были идентифицированы белок-белковые и белок-метаболитные взаимодействия в культурах трансгенных клеток арабидопсиса талиана. Клеточные культуры, экспрессирующие NDPK1, демонстрируют значительное обогащение валин-лейцином, изолейцина глутаматом, лейцином изолейцином и изолейцина фенилаланином по сравнению с пустыми образцами вектора, NDPK2 и NDPK3. Для поиска известных белок-белковых и белок-метаболитных взаимодействий 13 белков и четыре дипептида, со-элюирующих с NDPK1, были сопоставлены с базой данных стежков.

Основные ассоциации наблюдаются между ортологом APX1 и семейством альдегиддегидрогеназ, а также фактором инициации трансляции, FBR12, с фактором инициации трансляции второй субъединицы альфа-гомологом. Идентифицированные дипептиды не показывают зарегистрированных белковых партнеров. После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно держать образцы, оборудование и реагенты в холоде на протяжении всего эксперимента. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как микроскопический термофорез или анализ активности, чтобы определить прямое взаимодействие между молекулами или сделать вывод об их лиганде на активность белка. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как обращаться с образцом во время всей процедуры, чтобы получить достоверные результаты и определить лиганды выбранного вами белка.

Не забывайте, что работа с метанолом и раствором МТБЭ может быть крайне опасной. При выполнении этой процедуры следует всегда носить соответствующие средства индивидуальной защиты, а также соблюдать меры предосторожности, такие как работа под вытяжным шкафом.