Calorespirometry: Мощный, неинвазивная подход к расследованию клеточной энергии метаболизма

Общие цели этой процедуры заключаются в анализе метаболической активности биологического образца и определении степени, в которой анаэробные пути способствуют производству клеточной энергии в образце. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в фармацевтической области о степени митохондриальной токсичности во время разработки лекарств. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он облегчает одновременное измерение потребления кислорода и выработки тепла в исследуемом образце клетки.

Таким образом, этот метод может дать представление о планировании лечения на этапе фармацевтической разработки. Он также может быть применен в других областях, таких как циробиология, в которой можно оценить влияние метаболического предварительного кондиционирования на криоконсервацию. Чтобы подготовить респирометр, сначала добавьте две целых два миллилитра DMEM в каждую камеру респирометра и полностью вставьте пробки.

Отрегулируйте пробки с помощью инструмента для регулировки пробок и прокладки, чтобы обеспечить оптимальную диффузию кислорода к среде, и настройте камеры на непрерывное перемешивание образцов со скоростью 750 об/мин при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока концентрация кислорода и поток кислорода не станут стабильными. Убедитесь, что программное обеспечение респирометра запрограммировано на учет растворимости кислорода в среде, используемой в эксперименте. Затем выберите стабильный участок следа концентрации кислорода и откалибруйте этот участок для 100% насыщения воздухом.

Теперь закройте пробки, следя за тем, чтобы в камерах не было пузырьков. Примерно через 10 минут должен наблюдаться стабильный поток кислорода. Чтобы подготовиться к калориметрии, сначала добавьте в референсную ампулу два целых пять миллилитров деионизированной воды, затем закрутите крышку.

С помощью воздушного насоса удалите внешний мусор из ампулы, затем медленно опустите ампулу до положения первого в контрольном канале калориметра. Ампула будет оставаться в первом положении до тех пор, пока ампула с образцом клетки не будет подготовлена. DMEM, используемый для калориметрии, должен быть сбалансирован в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с увлажненной атмосферой и 5% CO2.

Начните эксперимент с добавления трех миллилитров DMEM в 100-миллилитровую пластину для каждой калориметрической ампулы, которая будет использоваться, и поместите пластину в инкубатор до тех пор, пока образец не будет готов к калориметрии. Пока среда уравновешивается, используйте инвертированный микроскоп, чтобы выбрать пластину с клетками HepG2, которые имеют конфлюентность от 60 до 80% и равномерно распределены. Сначала удалите питательную среду для клеток и промойте клетки два раза 10 миллилитрами PBS.

Добавьте три миллилитра предварительно подогретого при температуре 37 градусов Цельсия трипсина и инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия. После 7-10 минут инкубации нейтрализуйте ферментативную реакцию тремя миллилитрами 37 градусов Цельсия DMEM и используйте пятимиллилитровую пипетку, чтобы аккуратно диссоциировать клетки в одноклеточную суспензию. Переложите клетки в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров для центрифугирования и повторно суспендируйте палитру примерно в пяти миллилитрах свежего DMEM.

Тщательно пипетируйте клетки, чтобы разобщить любые клеточные кластеры, и после подсчета сконцентрируйте клетки примерно до двух миллионов клеток на 50 микролитров среды. Воспроизводимость этого метода зависит от последовательного и точного подсчета клеток. Крайне важно убедиться в том, что образец однороден и что клетки не слипаются ни на одном этапе анализа.

Затем храните клетки на льду до тех пор, пока они не будут готовы к выполнению респирометрических и калориметрических измерений. Перед калориметрическим измерением убедитесь, что калориметр подключен к компьютеру и что калориметрический сигнал стабилен и выражается в микроваттах. Разбавьте клетки до 100 000 клеток на миллилитр в уравновешенной среде, которая была помещена в инкубатор перед пробоподготовкой.

Затем добавьте два целых пять миллилитров клеточного раствора в каждую ампулу, подтвердив, что между крышками ампул и средой поддерживается достаточный объем воздуха для обеспечения диффузии газа. Немедленно затяните колпачки и очистите герметичные ампулы воздухом, чтобы удалить любой внешний мусор. Затем медленно опустите герметичную ампулу с клеткой образца до положения одного из калориметров.

Тщательно перемешайте образец, чтобы получить однородный раствор, и введите по два миллиона клеток в каждую закрытую камеру респирометра при непрерывном перемешивании. Через 15 минут в первом положении калориметра медленно опустите как референсную ампулу, так и ампулу с ячейками во второе положение и запишите время опускания. Через 10-15 минут после введения клеток в респирометр следует наблюдать стабилизацию потока кислорода и устойчивое снижение концентрации кислорода.

Чтобы определить герметичное дыхание, введите один микролитр четырех миллиграммов на миллилитр олигомицина в каждую камеру и дайте кислородному потоку стабилизироваться в течение примерно 10 минут, регистрируя стабильную скорость утечек дыхания, как показано выше. Затем, чтобы определить максимальный поток, введите в камеру два микролитра FCCP с нулевым значением две целых две миллимоля, позволяя кислородному потоку стабилизироваться после каждого впрыска, и продолжайте титрование до тех пор, пока не будет достигнут максимальный поток. Запишите стабильную частоту дыхания во время максимального потока.

Когда камера респирометра работает до измерения образца, концентрация кислорода и следы потока кислорода должны быть стабильными. После того, как ампула была опущена во второе положение, можно определить период времени, в течение которого тепловая мощность стабильна, и соответствующее время, в течение которого поток кислорода стабилен, чтобы можно было рассчитать калорспирометрическое соотношение. Если клетки HepG2 культивируются в отсутствие глюкозы и добавляется галактоза для увеличения митохондриального вовлечения, клетки не пролиферируют внутри калориметра, а вместо этого снижают свою метаболическую активность примерно через 30 минут в ампуле, ограничивая калореспирометрические расчеты самой ранней точкой времени, когда было измерено рассеивание тепла.

Очень важно записывать время дозирования клеток в ампулу, чтобы измерения теплопроизводства и потребления кислорода собирались в идентичные моменты времени, поскольку требуется примерно 15 минут, чтобы поток кислорода стабилизировался, а концентрация кислорода неуклонно снижалась. Поскольку стабилизированный поток кислорода в клетках служит суррогатом потребления кислорода при расчете калореспирометрического соотношения, могут быть выполнены дополнительные титрования для оценки герметичного дыхания, на которое указывает падение потока кислорода и максимальное несвязанное дыхание, на которое указывает неспособность увеличить дыхание при последовательном титровании FCCP. После освоения этой техники она может быть выполнена менее чем за четыре часа, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что другие клеточные линии могут иметь другие метаболические свойства. Поэтому каждая новая клеточная линия должна быть оптимизирована как для калориметрических, так и для респирометрических измерений. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить клетки HepG2 к калореспирометрии, чтобы обеспечить правильную инструментальную калибровку, а также правильно провести калореспирометрический эксперимент.