Потока на основе цитометрии Assay для измерения митохондриальных мембранный потенциал в культивировании после гипоксии/реоксигенацию

Этот метод может помочь измерить влияние гипоксии/реоксигенации на клетки в потенциале митохондриальной мембраны, а также может быть использован для оценки того, является ли агент защитным от травмы. Основное преимущество этого анализа заключается в том, что ММК обнаруживается им в случае наличия таких факторов, как размер митохондрий. Кроме того, он имеет низкие требования к материалам и блеску.

Начните с 70% сливающихся сердечных миоцитов человека в шестилуночном планшете. После промывания клеток фосфатным буфером физраствора добавьте препарат или средство в два миллилитра сыворотки и не содержащие глюкозы DMEM. Инкубируйте в инкубаторе для клеточных культур, содержащем 5% CO2 и 95% воздуха, при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут до начала гипоксии.

Через 30 минут поместите чашку с сердечными миоцитами человека в герметичную антибактериальную банку объемом 2,5 литра. Оснащен катализатором для удаления свободного кислорода и анаэробным индикатором для измерения напряжения кислорода в среде. Поместите банку в инкубатор для тканевых культур.

Цвет анаэробного индикатора изменяется от светло-голубого в нормоксической среде до бледно-белого в условиях гипоксии. Восстановите кислород в сердечных миоцитах человека, вынув шестилуночную пластину из банки и поместив ее на полку инкубатора на два часа. После реоксигенации промойте клетки одним миллилитром предварительно подогретого PBS и добавьте 0,5 миллилитра предварительно подогретого 25%-ного трипсина вдоль стенки лунки.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно одной минуты, пока все сердечные миоциты человека не будут почти отделены. Затем добавьте в лунки один миллилитр полной среды DMEM для нейтрализации трипсина. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и обалтируйте HCM центрифугированием при 500-кратном G в течение трех минут при комнатной температуре.

После центрифугирования осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Затем добавьте в каждую пробирку по 5 миллилитров полной среды сердечного миоцита человека и по 5 миллилитров рабочего раствора JC-1. Ресуспендируйте ГКМП с помощью пипетирования вверх и вниз.

Накройте пробирки алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить обесцвечивание флуоресцентного индикатора, и инкубируйте клетки в обычных условиях в течение 20 минут. После гранулирования сердечных миоцитов человека путем центрифугирования при 500-кратной G в течение трех минут в центрифуге, предварительно охлажденной до четырех градусов Цельсия, дважды промыть клетки двумя миллилитрами ледяного красящего буфера JC-1. После второго промывания ресуспендируйте сердечные миоциты человека в 300 микролитрах ледяного красящего буфера.

И отфильтруйте образцы в соответствующие пробирки для образцов. Проанализируйте клетки с помощью проточной цитометрии в течение 30 минут. Запустите проточный цитометр и убедитесь, что программное обеспечение подключено.

Выполните жидкостный запуск. Запустите трансляцию и настройте прерывание. Откройте два окна с точечными диаграммами в программе проточной цитометрии.

Выберите прямой рассеянный свет по оси X и боковой рассеянный свет по оси Y на первом точечном графике. Представить характеристики ячеек с точки зрения их размера и гранулярности, соответственно. Выберите канал обнаружения PE для оси Y.

И FITC для оси X, используя логарифмическую шкалу на втором точечном графике, который используется для измерения интенсивности цветения красителя JC-1 в клетках. Нажмите кнопку «Выгрузить», чтобы освободить опорный кронштейн пробирки, и поместите пустую пробирку с образцом, содержащую сердечные миоциты человека, которые не были окрашены JC-1. Нажмите кнопку «Нагрузить», чтобы вернуть опорный рычаг в рабочее положение.

Нажмите кнопку «Запись», чтобы собрать частицы из суспензии в пустой пробирке для образца. И отрегулируйте напряжения флуоресцентных каналов на втором точечном графике. Затворите популяцию клеток для дальнейшего анализа на первой точечной диаграмме.

Далее проанализируйте сердечные миоциты человека. Отобразите статистику по каждой пробирке с образцом и рассчитайте MMP для каждого образца, разделив отношение интенсивности красной флуоресценции на интенсивность зеленой флуоресценции. Гипоксия и реоксигенация в значительной степени индуцируют апоптоз сердечных миоцитов человека по сравнению с нормальными клетками, что измеряется соотношением аннексина PI.

китайская традиционная медицина с кардиопротекторным действием, предотвращала апоптоз ГКМП после гипоксии/реоксигенации. Как показано на рисунке, соотношение красного/зеленого цвета JC-1 после лечения митохондриальным ЦПК было почти нулевым. Согласуется с результатами анализа на апоптоз.

В группе, получавшей H/R, наблюдалось значительно более низкое соотношение красного/зеленого по сравнению с нормальной группой. И обратил вспять такое изменение соотношения. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что клетки, загруженные JC-1, должны находиться в ледяном буфере, так как температура оказывает значительное влияние на стабильность потенциала митохондриальной мембраны.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как генетические манипуляции, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, является ли снижение MMP результатом открытия MPTP.