Нейросферы Assay для оценки активации эндогенного нервных стволовых клеток мыши модели минимальная травма спинного

Этот метод может помочь ответить на вопросы, связанные с ролью нейральных клеток-предшественников в регенеративной медицине. В частности, мы можем задаться вопросом о том, как травма влияет на поведение нервных клеток-предшественников. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она обеспечивает подход к изучению влияния повреждения спинного мозга на кинетику эндогенных нейральных клеток-предшественников.

Визуальная демонстрация этих методов имеет решающее значение. Поскольку хирургические и диссекционные этапы требуют точности, и их может быть трудно освоить, хотя они могут быть усовершенствованы с практикой. Перед началом процедуры с помощью машинки для стрижки волос удалите шерсть со спинной части мыши под наркозом от середины спины до шеи и ушей.

Закрепив мышь в стереотаксическом устройстве, поместите четыре-пять кусков свернутой марли под брюшко, при этом слегка потянув за основание хвоста, чтобы выпрямить тело и позвоночник. Протолкните рулон грудной марли рострально от брюшка мыши к верхней части грудной клетки, чтобы поддержать грудной отдел позвоночника. И используйте лабораторную ленту, чтобы закрепить хвост и конечности в звездообразной ориентации.

После дезинфекции открытых участков кожи последовательными тампонами из 70% этанола и повидон-йода с помощью лезвия скальпеля No 10 сделайте вертикальный разрез, параллельный продольной оси животного, от середины обеих лопаток, до изгиба грудного отдела позвоночника. Втяните кожу, чтобы обнажить мягкие ткани и контур позвоночного столба. И определите нижнюю границу суперлопаточной жировой подушки.

Затем с помощью скальпеля осторожно, но с усилием разрежьте вдоль обеих сторон позвонка от Т5 до Т8 и девяти костей, чтобы отделить сухожилия задней мышцы от позвоночного столба. Расположите ретракторы так, чтобы зубы ретракторов были вставлены в место разреза по обе стороны от позвоночника. И расширяйте каждый ретрактор, чтобы отрегулировать экспозицию, пока позвоночник не будет достаточно поднят, не оказывая слишком большой нагрузки на втянутые мышечные слои.

Под операционным микроскопом тщательно очистите остаточные мышцы и другие мягкие ткани, лежащие над позвоночником, чтобы обнажить позвоночную кость. Обхватывание остистого отростка позвонков зубчатыми щипцами, а также небольшое перемещение щипцов вверх и вниз для выявления позвонков, которые будут удалены. Затем вставьте по одному кончику изогнутых тупых ножниц по обе стороны от открытого межпозвоночного отверстия, каудально по отношению к позвоночной пластинке, подлежащей иссечению.

А соединительные межпозвонковые суставы разрезать с двух сторон. Затем поднимите пластинку вверх и отрежьте верхнее крепление пластинки, чтобы изолировать и удалить кость. При отрезании и удалении пластинки позвонка всегда наклоняйте ножницы вверх, чтобы не повредить подлежащий спинной мозг.

С помощью дорсальных срединных вен, служащих ориентиром, вставьте согнутый под углом 45 градусов стержень кончика иглы 30 калибра скошенной стороной вверх на один миллиметр вглубь дорсальной боковой поверхности спинного мозга. И примерно на 0,5 миллиметра в сторону от средней линии. Переместите иглу примерно на два миллиметра от каудального к ростральному направлению, так, чтобы в шнур была введена вся длина скоса.

Затем повторите траекторию входа, чтобы извлечь иглу. Чтобы закрыть рану, удалите ретрактор и используйте рассасывающийся шов 6-0, чтобы соединить мышцы спины по обе стороны от травмы по средней линии. И шелковый шов 4-0 для закрытия вышележащей кожи.

Чтобы изолировать нейросферы, сделайте разрез по средней линии кожи по всей длине спины, чтобы обнажить контур мышц и позвоночных костей. Поднимите медиальную часть каждой лопатки и с помощью ножниц отрежьте мягкие ткани между лопаткой и позвонками. Когда нижележащий позвоночный столб будет обнажен, вставьте ножницы в верхнюю грудную апертуру, следуя кривизне позвоночного столба, и отрежьте прикрепленные ребра, мышцы и внутренние органы, чтобы изолировать позвоночный столб.

Вставьте ножницы в каудальное отверстие позвонка и разрежьте межпозвоночные суставы по обе стороны от пластинок, стараясь не повредить неповрежденный канатик. Когда спинной мозг будет обнажен на подходящей длине, осторожно перережьте все спинномозговые нервы, отходящие от спинного мозга в сторону, прежде чем перенести ткань спинного мозга в чашку Петри с обычной искусственной спинномозговой жидкостью на льду. Под микроскопом вскрытия разрежьте ткань спинного мозга так, чтобы она включала в себя около двух миллиметров ткани рострально и каудально к месту травмы, и с помощью двух пар тонких щипцов аккуратно разделите спинной мозг на две продольные половины, вдоль дорсальной и вентральной щелей.

С помощью микроножниц вырежьте поврежденное дорсальное латеральное белое вещество. И поместите травмированную ткань в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Удерживая одну половину спинного мозга щипцами, дразните и удалите неповрежденное белое вещество двумя парами щипцов вдоль рострального каудального отрезка спинного мозга, чтобы изолировать соответствующую перивентрикулярную область.

После выделения поврежденного белого вещества и связанных с ним перивентрикулярных областей от другой половины спинного мозга таким же образом, поместите кусочки перивентрикулярной ткани в отдельные конические трубки объемом 15 миллилитров. И с помощью микроножниц аккуратно измельчите ткань у стенок трубок. После того, как процедура расщепления тканей завершена и получена суспензия одиночных клеток, создайте культуру нейросферы, добавив 10 миллилитров соответствующей среды в одну колбу для культуры тканей объемом 25 миллилитров на каждое клеточное состояние.

И добавьте выделенные нейральные стволовые клетки с клональной плотностью до 10 клеток на микролитр для их культивирования в инкубаторе для клеточных культур. Через 24 часа аккуратно взболтайте колбы и сцедите содержимое в отдельные конические пробирки объемом 15 миллилитров для центрифугирования. Ресуспендируйте гранулы в одном-двух миллилитрах свежей нейронной базальной среды для подсчета.

И планшеты с клональной плотностью помещают в одну 24-луночную тканевую культуральную пластину на кондицию, содержащую 500 микролитров соответствующей среды, дополненной митогеном, на лунку. Затем выращивайте нейросферы в инкубаторе для клеточных культур в течение семи дней. Через пять дней после минимального повреждения спинного мозга абсолютное число дефинитивных нейросфер, полученных из нейральных стволовых клеток, больше, чем количество примитивных нейросфер, полученных из нейральных стволовых клеток.

Дефинитивные нейросферы имеют больший диаметр и большой темный центр. В то время как примитивные нейросферы меньше по размеру и более плотно упакованы. Минимальное повреждение спинного мозга индуцирует значительное увеличение нейросфер, отрастающих из центрального канала на уровне повреждения, по сравнению с относительно скромным увеличением в центральном канале, ростральном до уровня повреждения.

Дефинитивные нейросферы также могут быть сгенерированы из поврежденного белого вещества на уровне травмы. Область, которая не содержит нейросферообразующих клеток только у животных с ламинэктомией. Аналогичное увеличение примитивных нейральных стволовых клеток наблюдается и после травмы, за исключением примитивных нейросфер в белом веществе на уровне места поражения.

После освоения хирургической техники хирургическая техника может быть выполнена менее чем за 40 минут. А диссекция и изоляция тканей могут быть выполнены менее чем за 30 минут, если все выполнено правильно. После хирургической процедуры, в зависимости от штамма животного, могут быть использованы дополнительные методологии, такие как иммуногистохимия и линеатный шок, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как кинетика пролиферации и самосудьба нейральных клеток-предшественников после травмы.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать анализ нейросферы для оценки активации нейральных стволовых клеток после травмы спинного мозга.