Заготовка Venom токсины от убийца ошибок и других насекомых, Heteropteran

Клопы-убийцы — это группа насекомых, которые используют яд для паралича и предварительного переваривания своей добычи. Однако, несмотря на то, что яды животных представляют интерес как новые лекарства, инсектициды и научные инструменты, токсины, которые они производят, почти полностью не охарактеризованы. Одна из причин этого заключается в том, что жуки-убийцы менее известны по сравнению с ядовитыми членистоногими, такими как пауки и скорпионы.

Другая причина заключается в том, что до недавнего времени было мало информации о том, как собирать их токсины. В этом видео мы представим методы, которые позволят исследователям успешно собирать токсины яда от клопов-убийц, а также от родственных насекомых, таких как гигантские водные клопы, убивающие рыбу. В первом протоколе описывается, как собирать яд с помощью электростимуляции.

Для начала соберите подходящих насекомых. Со взрослыми особями и крупными нимфами работать проще всего. Использование насекомых через два-семь дней после кормления является идеальным, чтобы убедиться, что насекомые накопили запасы яда, но не голодают.

Подготовьте пару щипцов с электродами на концах и подключите их к электросети. В идеале это должен быть электростимулятор, способный выдавать пятимиллисекундные импульсы с частотой в пять Гц. Используйте пиковое напряжение от 15 до 25 вольт для маленьких или крупных жуков соответственно.

Если электростимулятор недоступен, используйте постоянное напряжение от пяти до 12 вольт. Удерживают насекомое с помощью резинок и поролоновой платформы. Поместите хоботок насекомого в сборную трубку.

Трубка для дозатора P200 идеально подходит для большинства жуков-убийц. По желанию, небольшое количество воды можно добавить в кончик перед сбором урожая, чтобы обеспечить максимальное восстановление яда. Нанесите на электроды проводящий гель, включите электропитание и приложите к насекомому наэлектризованный пинцет.

Экспериментируйте с различными точками контакта, контролируя выделение яда из хоботка. Храните яд при температуре замерзания, чтобы избежать аутопротеолитического пищеварения. Повторяйте электростимуляцию с помощью новой трубки для дозатора до тех пор, пока яд не прекратится.

Протокол 2 описывает, как собрать яд, провоцируя защитную реакцию. Подготовьте и удержите клопа так, как описано выше, вставив хоботок в сборный наконечник. Осторожно издевайтесь над жуком, чтобы спровоцировать защитную реакцию, не травмируя животное.

Иногда простое удержание животного или введение хоботка в пробирку для сбора может спровоцировать защитную реакцию, сопровождающуюся изгнанием яда из хоботка. Если нет, осторожно прикоснитесь к животному за грудную клетку, ноги, брюшко и особенно за усики, чтобы вызвать яд. В третьем протоколе, в письменной форме этой статьи, мы также описываем, как собирать яд у видов, которые плюются ядом в оборонительных целях.

В четвертом протоколе описывается, как получить яд непосредственно из ядовитых желез путем вскрытия. Обезболить животных путем воздействия углекислого газа в течение 10 минут. Вставьте три штифта в заднюю часть брюшка, чтобы удержать насекомое, не прокалывая ядовитые железы.

Сделайте короткий разрез по средней линии на вентральной поверхности живота с помощью миниатюрного скальпеля. Используйте миниатюрные ножницы, чтобы продлить среднюю линию в переднем направлении к голове, стараясь обрезать только экзоскелет и не повредить внутренние структуры. Чтобы обнажить внутренние структуры, сделайте множественные боковые надрезы, простирающиеся от разреза по средней линии до боковой части насекомого.

Брюшной экзоскелет между каждыми двумя разрезами может быть затем прикреплен обратно, чтобы обнажить внутренние структуры. Залейте лоток для вскрытия солевым раствором до тех пор, пока жук не погрузится в воду, что позволит внутренним структурам всплыть вверх и их будет легче визуализировать. Ядовитые железы будут выглядеть как полупрозрачные удлиненные структуры, простирающиеся по обе стороны пищеварительного канала.

С помощью пинцета и микроножниц аккуратно удалите соединительную и нервную ткань и трахею, стараясь не разорвать пищеварительный канал или ядовитые железы. Главная железа узнаваема благодаря своему характерному строению, с передней и задней долями и двумя протоками, сходящимися в воротах. У клопов-убийц, а возможно, и других гетероптерокрылых, почти все токсины хранятся в просвете двух долей главной железы.

Поэтому, освободив основную железу от трахеи и соединительной ткани, можно перерезать два протока, отходящих от воротка, и собрать основную ядовитую железу. Если добавочная железа также желательна, она обычно тесно противоположна кишечнику и может быть однозначно идентифицирована по протокам от ворот. В любом случае, следите за тем, чтобы железы не сломались преждевременно и не потеряли яд в окружающий физиологический раствор.

Если необходимо отделить доли главной железы, сделайте это сразу после удаления из физиологического раствора и немедленно приступайте к сбору содержимого просветов железы, как описано в пунктах 4.6 и 4.7 написанной рукописи. Результаты будут варьироваться в зависимости от конкретного подпротокола и вида используемого насекомого. Первый и второй подпротоколы, представленные в этом видео, показали, как собирать токсины яда с помощью электростимуляции и домогательства соответственно.

Оба этих метода обычно дают концентрированную жидкость, содержащую примерно от 50 до 250 мг белка и более 100 белковых компонентов, включая ферменты, порообразующие токсины и пептиды. Принципиальное преимущество обоих этих протоколов заключается в том, что они быстрые, нелетальные, и яд не загрязнен железистой тканью. Самым большим недостатком для забора с помощью электростимуляции или домогательства является то, что железистый источник полученного яда неизвестен, а содержание белка в собранном яде может отличаться, в зависимости от протокола.

Кроме того, электростимуляция и преследование эффективны не для всех хищных видов heteroptera. В последнем подпротоколе мы показали, как препарировать набухшие ядовитые железы для непосредственного сбора токсинов. Этот метод также позволяет получить коктейль из разнообразных белков, хотя в этом случае токсины яда могут демонстрировать некоторое загрязнение железистой ткани.

Тем не менее, преимущество сбора токсинов из рассеченных желез заключается в том, что железистый компартмент происхождения точно известен. В заключение мы призываем исследователей выбрать метод сбора урожая, соответствующий их исследовательскому вопросу. Например, исследования биологии использования яда в пределах вида выиграют от использования нескольких методов сбора.

Для биопоисковых исследований один метод сбора ядов нескольких видов может быть более экономичным, в зависимости от конкретного плана эксперимента. Мы надеемся, что это видео и сопроводительная статья помогут исследователям собрать яд из клопов-убийц и других гетерокрылых насекомых, что является предпосылкой для понимания его состава, биологической активности и эволюции.