Оценивая роль митохондриальной функции в связанных с раком усталость

Общей целью этой процедуры является оценка митохондриальной дисфункции, связанной с усталостью у онкологических больных. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области поддерживающей онкологической терапии, например, связана ли митохондриальная дисфункция с усталостью у пациентов с раком после прохождения лучевой терапии. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она менее инвазивна и может быть легко использована в клинике для выявления пациентов с риском токсичности от терапии рака.

Этот метод не только улучшает наше понимание роли митохондриальной дисфункции в усталости, связанной с раком, но также может улучшить оценку и оптимизировать ее лечение. Хотя этот метод может дать представление об основных механизмах усталости, связанной с раком, он также может быть применен к другим утомляющим заболеваниям, таким как метаболические и воспалительные состояния мочевыводящих путей. Как правило, для людей, плохо знакомых с этим методом, может быть сложно правильно вводить ингибиторы дыхания в каждый порт сенсорного картриджа без предварительной визуальной демонстрации.

Демонстрировать эту процедуру будет г-н Куанг Нгуен, научный сотрудник нашей лаборатории. Чтобы увлажнить картридж датчика, сначала извлеките его из упаковки. Затем добавьте по 200 микролитров калибровочного раствора в каждую лунку бытовой плиты.

Также заполните каждый ров 400 микролитрами калибровочного раствора. Затем верните пластину датчика на рабочую пластину и начните гидратацию картриджа в инкубаторе без углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. Измерьте уровень усталости на основе функциональной оценки терапии хронических заболеваний, состоящей из 13 пунктов.

Усталость на исходном уровне, в середине срока, по завершении ДЛТ и через год после ДЛТ. Сначала подготовьте среду для анализа для измерения функции митохондрий. После приготовления среды прогрейте ее до 37 градусов по Цельсию и отрегулируйте pH до 7,4.

Важно следить за тем, чтобы пробирная среда была подготовлена в день проведения эксперимента и прогрета до 37 градусов до регулировки PH до 7,4. Затем засейте PBMC в каждую лунку, чтобы достичь 80-90-процентной конфлюенции. Затем закрутите пластину при 200 умноженных на g в течение 2 минут, чтобы ячейки прилипли к дну лунок.

После отжима удалите среду из каждой лунки и промойте лунки один раз пробирной средой. Добавьте по 180 микролитров пробирной среды в каждую лунку, включая фоновые лунки. Затем инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе без углекислого газа в течение 45-60 минут.

Для восстановления лекарственных средств в препарат добавляют 252 микролитра пробирной среды для получения 50 микромолярного стокового раствора олигомицина. Добавьте в препарат 288 микролитров пробирной среды для получения 50 микромолярного стокового раствора FCCP. Наконец, добавьте 216 микролитров исследуемой среды, чтобы получить 25 микромолярного стокового раствора антимицина а/ротенона.

После восстановления всех трех препаратов вихревую суспензию препарата в течение одной минуты, а затем разбавить рабочие растворы. Затем пипеткой в каждую лунку впрыскивают 20 микролитров 10 микромолярного олигомицина в порт А до конечной концентрации по одному микромоляру. Далее пипетку 22 мкл 10 микромолярного FCCP в порт В до конечной концентрации одного микромоля в каждой лунке.

Наконец, пипетку 25 микролитров 5 микромолярного антимицина а/ротенона в порт С до конечной концентрации 0,5 микромоль в каждой лунке. Затем выберите стресс-тест Мито на приборе для измерения внеклеточного потока. Затем вставьте картридж датчика, следуя подсказке прибора.

Прибор автоматически выполнит калибровку датчика. После завершения калибровки вставьте клеточную пластину, чтобы прибор завершил оставшуюся часть анализа. Для приготовления раствора для анализа пролиферации клеток в 1,405 мл фосфатного буферного раствора добавляют 5,76 мкл красителя нуклеиновой кислоты и 28,8 мкл супрессора фона.

После завершения стресс-теста Mito добавьте по 180 микролитров 2x рабочего раствора непосредственно в среду в каждую лунку. Затем инкубируйте клетки с раствором для анализа пролиферации клеток при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45-60 минут. Количественно измерьте количество живых клеток на планшетном считывателе при возбуждении 508 нанометров и излучении 527 нанометров с последующей нормализацией данных OCR.

При выполнении титрования по ПКХП оптимальной концентрацией препарата является один микромоляр, который используется для оценки митохондриальной функции ПКМЦ. Исследование митохондриального дыхания и недавно выделенных PBMC показывает, что OCR начинает снижаться через три часа и продолжается до восьми часов. Однако максимальное дыхание, вызванное введением FCCP, также не превышает базального уровня OCR.

Здесь показана нормализация функции митохондрий при выделении клеток от двух здоровых особей. На самом деле, OCR, нормализованный к живым клеткам, представленным зеленым флуоресцентным ДНК-связывающим красителем, одинаков у обоих здоровых людей. На самом деле, существенной разницы в базальном OCR между здоровым и утомленным субъектом не наблюдается.

Тем не менее, усталый субъект демонстрирует сниженное максимальное потребление кислорода и резервную дыхательную способность по сравнению с контрольной группой. Не обнаружено различий в потреблении кислорода, не связанном с митохондриями и АТФ, или в эффективности взаимодействия между здоровыми и усталыми субъектами. После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что сначала необходимо определить оптимальную плотность клеток и концентрацию FCCP. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как выделение различных клеточных популяций, чтобы руководить будущими механистическими исследованиями, сосредоточенными на конкретных типах клеток. После его разработки этот метод проложил путь исследователям в области поддерживающей терапии к изучению роли митохондриальной дисфункции у усталых онкологических больных.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как измерять функцию митохондрий и клинические образцы, которые также могут быть использованы для упреждающего выявления пациентов с риском развития токсичности, связанной с лечением рака, включая усталость. Не забывайте, что работа с ингибиторами дыхания, такими как олигомицин и ротенон, может быть чрезвычайно опасной. При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты.