Бронхоальвеолярный лаваж Exosomes в Липополисахарид индуцированной септик легких травм

Мышей в внутрибрюшинного ПЛАСТИНОК выделяют exosomes в жидкости бронхо альвеолярные промывание (БАЖ), которые упакованы с адаптивной. С помощью системы совместного культуры, мы показывают, что exosomes, выпущенный в жидкости бал нарушить экспрессию белков жесткой перехода в бронхиальной эпителиальных клеток и увеличить выражение провоспалительных цитокинов, что подчеркнет повреждения легких.

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы определить роль экзосом в воспалительных реакциях на мышиной модели острого септического повреждения легких, вызванного ЛПС. Таким образом, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с перекрестными коммуникациями между клетками при остром повреждении легких и остром респираторном дистресс-синдроме. Особенно межклеточная коммуникация в альвеолярно-микросреде посредством челночного перемещения экзосом.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет выделить и охарактеризовать высокоочищенные экзосомы бронхоальвеолярного лаважа, полученные от обработанных эндотоксинами септических мышей с острым повреждением легких. Демонстрируют процедуру д-р Чжихун Юань и д-р Четна Беди. Для начала загрузите в одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 27 калибра, 0,1 миллилитра LPS и PBS на каждую мышь и вручную ограничьте первого шести-восьминедельного самца черной мыши C57 6J.

Введите ЛПС внутрибрюшинно и верните животное в клетку. Через 24 часа сделайте пятимиллиметровый разрез в центре шеи первого животного и с помощью тупых щипцов аккуратно разделите мышцы, чтобы обнажить трахею. Далее аккуратно введите иглу 27 калибра, прикрепленную к стерильному шприцу объемом 10 миллилитров, в трахею и введите один миллилитр стерильного PBS.

Затем немедленно замените 10-миллилитровый шприц на трехмиллилитровый, оснащенный новой иглой 27 калибра. Отсадите жидкость для бронхоальвеолярного лаважа или BOLF и добавьте BOLF в коническую пробирку объемом 15 миллилитров на льду с соответствующей маркировкой. Чтобы выделить экзосомы, центрифугируйте образцы BOLF и перенесите надосадочную жидкость в новые 15-миллилитровые пробирки.

Снова центрифугируйте образцы и перенесите надосадочную жидкость в ультрацентрифужные пробирки для удаления более крупных ячеистых частиц. Перенесите надосадочную жидкость в новые конические пробирки и загрузите образцы в шприцевые фильтры размером 0,2 микрона, чтобы удалить оставшиеся более крупные частицы. Добавьте отфильтрованные образцы в новые ультрацентрифужные пробирки, чтобы гранулировать экзосомы.

Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы по 100 микролитров PBS на тюбик. Затем переложите образцы экзосом в отдельные пробирки объемом 1,5 миллилитра для их хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы очистить экзосомы, добавьте 0,4 микролитра соответствующего красителя для экзосом в одну пробирку, содержащую 100 микролитров раствора суспензии на образец, и быстро добавьте по одному размороженному образцу экзосомы в каждую пробирку с красителем.

Тщательно перемешайте экзосомы с красителем и инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение пяти минут, защищенных от света. В конце инкубации поместите одну спин-колонку экзосом на образец в 1,5-миллилитровую иллюзорную трубку и перенесите растворы экзосом в центр каждой спиновой колонки. Затем центрифугируйте образцы, выбросьте колонки и храните упомянутые образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Чтобы измерить поглощение экзосом клетками-реципиентами, сначала засейте 12 клеток эпителия легких мыши по 10 до 12 мл в 0,5 мл среды в каждую лунку предметного стекла с восемью лунками для 16-часового культивирования при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. После размораживания добавьте по 10 микролитров очищенных флуоресцентных меченых экзосом в каждую лунку и верните клеточные культуры в инкубатор на один час. В конце инкубации промойте клетки PBS и зафиксируйте каждую сокультуру 1%-ным параформальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре.

Извлеките носитель, а затем установите предметное стекло с носителем, дополненным DAPI, и визуализируйте образцы с помощью флуоресцентной микроскопии с 40-кратным увеличением. Чтобы проверить взаимодействие экзосом с клетками-реципиентами, засейте 2 раза по 10 до пятого эпителия легких мыши 12 клеток по два миллилитра среды на лунку в 12-луночный планшет, содержащий соответствующую питательную среду для двухчасовой инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе. В конце инкубации добавьте 20 мкг экзосом в три лунки эпителиальных клеток на каждую опытную группу и верните клетки в инкубатор.

Через 24 часа удалите среду, промойте клетки PBS, и добавьте в каждую лунку по 600 микролитров буфера для лизиса с легким встряхиванием. Затем переложите все содержимое каждой лунки в отдельные пробирки объемом 1,5 миллилитра и проанализируйте образцы по стандартным протоколам ПЦР в реальном времени. В течение 24 часов после введения ЛПС наблюдается нейтрофильный приток в легкие животных, получавших ЛПС.

После их выделения и очистки, как только что продемонстрировано, присутствие экзосом в BOLF от животных с септическим поражением легких может быть подтверждено с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Экспрессия отдельных провоспалительных микроРНК значительно увеличена в экзосомах бронхоальвеолярной жидкости от животных, получавших ЛПС, по сравнению с контролируемыми мышами, получавшими ПБС. Экзосомы, обработанные ЛПС, поглощаются эпителиальными клетками бронхиол мыши, о чем свидетельствует ко-локализация экзосом, меченных флуоресцентными красителями, с клетками, меченными DAPI, после одного часа совместного культивирования.

Экспрессия провоспалительных медиаторов значительно увеличена в эпителиальных клетках, совместно культивируемых с экзосомами от животных, получавших ЛПС, по сравнению с кокультивированием с экзосомами от контрольных мышей, получавших ПБС. Кроме того, клетки, обработанные экзосомами мышей, обработанных ЛПС, демонстрируют значительно ослабленную экспрессию zonula occludens one по сравнению с контрольной группой, указывающей на менее интактную целостность клеток после совместной культуры экзосом, обработанных ЛПС. Внутрибрюшинное введение ЛПС, экстракция бронхоальвеолярного лаважа и делегирование экзосом из бронхоальвеолярного лаважа – все эти этапы могут быть выполнены за относительно короткий промежуток времени.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как совместное культивирование экзосом и эпителиальных клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы о перекрестной связи между врожденными и структурными клетками в альвеолярном микроокружении легких. Перекрестное взаимодействие между врожденными, иммунными и структурными клетками посредством челночного перемещения экзосом способствует воспалительной реакции и нарушению структурного барьера, предполагая, что нацеливание экзосомальной микроРНК может обеспечить нормальную платформу для лечения острого повреждения легких и острого респираторного дистресс-синдрома. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как вызвать септическое повреждение легких у мышей, выделить бронхоальвеолярную жидкость лаважа у мышей, изолировать экзосомы из жидкости промывания и использовать модель совместного культивирования для опроса внутриклеточных перекрестных разговоров.

Не забывайте, что работа с LPS может быть опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующих средств индивидуальной защиты.