Производство белка эластина как гидрогели для инкапсуляции и иммуноокрашивания клеток в 3D

Общая цель этого протокола заключается в экспрессии и очистке рекомбинантно полученных эластиноподобных белков для использования в качестве настраиваемого гидрогеля для инкапсуляции 3D-клеток. Кроме того, в этом протоколе представлена методология нисходящего флуоресцентного мечения в конфокальной микроскопии инкапсулированных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биоматериалов, регенеративной медицины и клеточной биологии, такие как понимание роли взаимодействий между клеткой и внеклеточным матриксом в 3D.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает воспроизводимую, настраиваемую и модульную материальную платформу, которая поддается изучению нескольких типов клеток. В целом, внедрение этого метода может улучшить наше понимание критических параметров клеточной передачи сигналов ВКМ, которые могут определять успех будущих клеточных регенеративных терапий. Направьте агаровую пластину с ампициллином и хлорамфениколом на предварительно изготовленный бактериальный материал, содержащий вектор, кодирующий интересующую ELP.

Затем инкубируйте пластину с полосами вверх дном при температуре 37 градусов Цельсия на ночь, чтобы дать возможность размножиться бактериям. На следующий день выберите одну колонию из тарелки и привите предварительно подогретую закваску. Инкубируйте культуру в шейкере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов.

После инкубационного периода с помощью серологической пипетки передайте по 20 миллилитров закваски в каждую колбу для сцеживания. Оставьте колбу для сцеживания встряхивать в течение часа. Через час измерьте оптическую плотность на уровне 600 нанометров аликвоты из колбы с выражением.

Как только показания достигнут 0,6, снизьте температуру шейкера до 32 градусов по Цельсию. Когда показания достигнут 0,8, добавьте один миллилитр одного моляра стерильной фильтрованной IPTG для индуцирования экспрессии ELP в экспрессивной колбе. Дайте культуре проявиться в течение семи часов.

Через семь часов центрифугируйте сцеживающую среду при 12 000 x g в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия в напольной центрифуге. После центрифугирования с помощью шпателя соберите клеточную гранулу из контейнера центрифуги и поместите ее в предварительно взвешенный пакет с застежкой-молнией. Далее растворите клеточную гранулу в стерильном фильтрованном буфере TEN.

Массирующими движениями нанесите на клеточную гранулу до образования однородного раствора. Заморозьте пакет с застежкой-молнией с ресуспензионной клеточной гранулой во вторичном контейнере при температуре 80 градусов Цельсия. К размороженной клеточной грануле добавьте примерно от 30 до 40 миллиграммов дезоксирибонуклеазы и один миллилитр 100 миллимолярного PMSF на каждые 100 миллилитров клеточного лизата.

Инкубируйте лизат при температуре четыре градуса Цельсия в шейкере на ночь. После третьего цикла замораживания-оттаивания центрифугируйте образцы при давлении не менее 15 000 x g в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования слейте надосадочную жидкость из контейнера центрифуги и перелейте раствор в новый контейнер для центрифуги.

На каждые 100 миллилитров надосадочной жидкости добавьте 5,84 грамма хлорида натрия в трех частях к конечной концентрации в один моляр. Инкубируйте суспензию в встряхивающем инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. После инкубации образцы центрифугируют при давлении не менее 15 000 x g в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия.

После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость из контейнера центрифуги и смассируйте гранулу. Далее добавьте 10 миллилитров автоклавированной сверхчистой воды на грамм гранулы, полученной после центрифугирования. Чтобы белок полностью растворился, используйте металлический шпатель для разминания и ресуспензии гранулы.

Инкубируйте ресуспендированную гранулу при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи на орбитальном шейкере. Повторяйте этапы холодного и горячего центрифугирования в общей сложности в течение трех циклов для дальнейшей очистки ELP. Затем наберите остаточную надосадочную жидкость в диализной мембране с температурой 3,5 килодальтона против четырех литров предварительно охлажденной сверхчистой воды при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех дней, чтобы обессолить белковый раствор.

Окончательную диализованную раствор центрифугировать в предварительно охлажденной центрифуге. Заморозьте надосадочную жидкость при температуре 80 градусов Цельсия в предварительно взвешенной конической пробирке. Наконец, лиофилизируйте замороженный раствор в течение трех дней, а затем взвесьте окончательный лиофилизированный продукт, чтобы определить выход белка.

С помощью пробойника для биопсии создайте отверстия в силиконовом листе толщиной 0,5 миллиметра. Затем вырежьте квадрат вокруг каждого отверстия. Затем с помощью пинцета снимите полиэтиленовую пленку с каждой стороны отдельных форм.

После снятия полиэтиленовой пленки с помощью пинцета расположите идентичное количество голых силиконовых форм и стекол для крышки в чередующиеся ряды на крышке 48-луночной пластины для последующего плазменного склеивания. После того, как все материалы для клеточных культур изготовлены, можно начинать подготовку интересующего типа клеток для последующей инкапсуляции гидрогелем. После диссоциации клеток в одиночную клеточную суспензию насыпьте желаемое количество клеток в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Затем центрифугируйте клетки при температуре примерно 200 x g в течение трех минут. После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость и храните гранулу на льду. Суспендируйте клеточную гранулу в исходном растворе ELP до 80% от конечного объема.

Затем с помощью пипетки смешайте раствор в однородную суспензию клеток в ELP. Для оставшихся 20% конечного объема добавьте стоковый раствор THPC в суспензию ELP ячейки. Пипетку несколько раз обеспечить образование однородной смеси, при этом не допуская образования пузырьков воздуха.

Затем круговыми движениями нанесите смесь ELP THPC в каждую форму в 24-луночной пластине. Затем инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 15 минут. Через 15 минут инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия еще 15 минут.

После окончания инкубации осторожно добавьте 750 микролитров теплой среды для клеточных культур в каждую лунку в 24-луночной пластине. Оставьте гидрогель при температуре 37 градусов Цельсия на желаемое время культивирования. Сначала отсасывайте среду из каждой лунки.

Затем промойте лунки одним миллилитром теплого DPBS. После того, как промывка будет завершена, добавьте в каждую лунку по 750 микролитров раствора для фиксации. Затем инкубируйте 24-луночный планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

После инкубации отсасывайте раствор фиксации из каждой лунки и выбросьте фиксатор в контейнер для опасных отходов. Далее добавьте в пробу один миллилитр DPBS и сразу же выбросьте DPBS в контейнер для опасных отходов. Затем добавьте 750 микролитров раствора для проникновения образца в течение одного часа при комнатной температуре на коромысле со скоростью 15 оборотов в минуту.

Через час отсадите раствор для пермеабилизации и добавьте в образец 750 микролитров блокирующего раствора. Оставьте образец на коромысле при комнатной температуре на три часа. Затем разбавьте желаемые первичные антитела раствором для разведения антител.

Далее добавьте по 500 микролитров раствора антитела в каждый образец. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день аспирируйте первичный раствор антитела, затем промывайте образцы PBST в течение одного часа трижды при комнатной температуре со скоростью 15 оборотов в минуту.

Затем разведите соответствующие вторичные антитела в пяти миллиграммах на миллилитр стокового раствора DAPI до достижения конечной концентрации 2,5 микрограмма на миллилитр. Затем добавьте по 500 микролитров раствора в каждый образец. Затем используйте алюминиевую фольгу, чтобы накрыть 24-луночную пластину, и инкубируйте пластину при температуре четыре градуса Цельсия на ночь.

На следующий день аспирируйте вторичный раствор антитела и промойте образцы PBST трижды в течение 30 минут при комнатной температуре на коромысле. Затем поместите каплю твердого монтажного материала на поверхность предметного стекла и поместите образец на монтажный материал. Наконец, используйте лак для ногтей, чтобы прикрепить образцы к предметному стеклу стеклянной крышки, чтобы предотвратить загрязнение или перемещение образца.

Здесь экспрессия целевого белка с полноразмерным ELP в контролируемых условиях подтверждается наличием полос на 37 килодальтонах как в SDS-PAGE, так и в вестерн-блоттинге. Однако в неконтролируемых условиях несколько низкомолекулярных полос также видны с помощью вестерн-блоттинга. Полосы с более низкой молекулярной массой соответствуют белкам с менее чем четырьмя эластиноподобными повторами доменов, что указывает на то, что белок не полностью транслируется во время экспрессии.

Этот результат часто встречается при проведении сеньории выше 32 градусов по Цельсию. Для варьирования концентрации клеточного адгезивного лиганда при сохранении постоянных механических свойств гидрогеля настраивают соотношение варианта ELP, содержащего клеточный адгезий, полученный из фибронектина, и неклеточных адгезивных последовательностей. Кроме того, мышиные нервные клетки-предшественники также жизнеспособны в течение семи дней при инкапсуляции в 3%-ный гидрогель ELP.

Живые клетки обозначены зеленым цветом из-за окрашивания кальцеином AM, в то время как красный гомодимер этидия преимущественно поглощается мертвыми клетками. Для валидации фенотипа стволовых клеток нейральных клеток-предшественников экспрессия канонических маркеров, таких как Sox2 и нестин, также визуализируется путем иммуноокрашивания, когда клетки инкапсулированы в гидрогели 3D ELP. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как экспрессировать и очищать эластиноподобный белок для последующей инкапсуляции различных типов клеток, а также исследовать роль 3D-микроокружения в модуляции клеточного фенотипа.