В естественных условиях Электрофизиологические измерения потенциал действия соединения мышц от передних конечностей в моделях мыши дегенерации двигательного нейрона

С помощью этого метода мы можем оценить дегенерацию аксонов, а также демиелинизацию в периферических нервах мышиных моделей нейродегенерации. Основное преимущество этой методики заключается в том, что этот минимально инвазивный метод возможен для повторных измерений, только один из которых не отслеживался из нескольких нервов у одних и тех же животных. Чувствительность этого метода позволяет обнаруживать потери аксонов в модуляции на ранних стадиях, еще до того, как будет зарегистрировано заметное количество дефектов, что позволяет обнаруживать эти дефекты на ранней стадии.

Чтобы начать эту процедуру, обезболите мышь с помощью ингаляции кислорода изофлураном. Подтвердите адекватную анестезию, слегка надавливая на подушку для ходьбы задних конечностей, чтобы проверить отсутствие рефлекса отмены боли. Затем поместите носовой конус на морду животного для поддержания анестезии.

Следите за тем, чтобы носовой конус не блокировал дыхательные пути и животное дышало ровно. Далее поддерживайте температуру тела животного на уровне 37 градусов по Цельсию с помощью термостатической нагревательной пластины. Чтобы измерить CMAP на задней конечности, расположите мышь в положении лежа.

Вытяните заднюю конечность и приложите лапу к рабочей поверхности с помощью скотча. Затем поместите пять миллиметров стимулирующих электродов 27 калибра подкожно с обеих сторон седалищного узла, не прокалывая нижележащие мышцы с расстоянием в два сантиметра между электродами. Аналогичным образом поместите записывающий электрод подкожно над икроножной мышцей и параллельно ейкроножной мышце.

После этого поместите электрод сравнения подкожно рядом с ахилловым сухожилием под углом 30 градусов и оставьте от двух до пяти миллиметров иглы под кожей. Поместите заземляющий электрод подкожно на боковую сторону мыши таким же образом, как и стимулирующие электроды. Чтобы измерить CMAP на передних конечностях, расположите мышь на коврике для головы в положении лежа на спине и с помощью клейкой ленты удлините обе передние конечности по бокам тела.

Затем поместите пять миллиметров стимулирующего электрода подкожно, не прокалывая нижележащие мышцы с обеих сторон передней конечности, чтобы выровнять их с нервом плечевого сплетения. Затем поместите записывающий электрод подкожно над двуглавой мышцей плеча. Затем поместите три миллиметра электрода сравнения под углом 30 градусов на прогулочные коврики и вставьте заземляющий электрод подкожно сбоку мыши.

В этой конфигурации электроды находятся в непосредственной близости друг от друга. Не допускайте соприкосновения электродов друг с другом, так как это искажает запись. Стимулируйте все аксоны с помощью одного импульса в секунду с длительностью стимуляции 0,1 миллисекунды.

Чтобы получить данные, начните стимуляцию, нажав кнопку рекуррентного стимула в блоке контроллера, и поверните ручку регулятора интенсивности, чтобы увеличить стимул. Чтобы достичь сверхмаксимальных стимулов, применяйте увеличивающие стимулы, поворачивая ручку регулятора интенсивности до тех пор, пока амплитуда ответа CMAP не перестанет увеличиваться. Оттуда еще больше увеличьте стимул на 20%, чтобы убедиться, что амплитуда CMAP достигла своего максимального отклика.

Завершите стимуляцию, снова нажав кнопку повторного стимула. С помощью инструмента «Маркер» укажите следующие точки в записи. Инициация ответа, максимальный положительный пик и максимальный отрицательный пик.

Инициирование стимула определяется программным обеспечением автоматически. Определите задержку как задержку от инициирования стимула до начала ответа. Используйте задержку для оценки демиелинизации в аксонах.

Измерьте амплитуду от максимального отрицательного до максимального положительного пика и используйте величину амплитуды для корреляции числа функциональных аксонов. Поскольку точное расположение электродов может повлиять на итоговое значение записи, замените электроды и измерьте один и тот же нерв три раза, используя сверхмаксимальный стимул, чтобы обеспечить получение наибольшего отклика. Используйте среднее значение записей.

После измерений снимите все электроды и оставьте мышь восстанавливаться на нагревательной пластине или под инфракрасной лампой примерно на две-пять минут, пока она не придет в сознание. Не оставляйте мышь без присмотра и в компании других мышей до тех пор, пока она полностью не оправится от наркоза. Мыши C61 PMP22, экспрессирующие три-четыре копии человеческого PMP22 и гетерозиготные мыши, повторяют очень легкий фенотип заболевания CMT1A с легкой демиелинизацией и сниженными CMAP, но без видимого фенотипа.

У трансгенных мышей C61, PMP22 в возрасте от полутора до двух лет амплитуды CMAP снижены, а латентности удлинены как в задних, так и в передних конечностях. Амплитуда была снижена как в задних, так и в передних конечностях у трансгенных мышей, а латентность была удлинена во всех конечностях у трансгенных мышей с ШМТ, и при этом измерении были обнаружены даже незначительные изменения в передних конечностях. Потребность в интенсивности стимула была повышена у мышей C61 PMP22, что напоминает выявленный фенотип у пациентов с CMT1A.

После освоения CMAP запись может быть сделана как для задних, так и для передних конечностей за 15 минут при правильном выполнении. Представленная методика открывает новые возможности для характеристики мышиных моделей нейродегенеративных заболеваний, таких как амиотрофический склероз широчайших мышц глаза и болезнь Шарко-Мари-Тута. Оценка функциональности аксона нерва дает подробную информацию о прогрессировании нервно-мышечных нарушений.

Подобные записи используются в клинических условиях, что подчеркивает трансляционный потенциал этого метода.