Анализ AtHIRD11 внутренние беспорядки и привязки к ионов металлов Капиллярный электрофорез и близость капиллярного электрофореза

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся тектоники белков внутренних нарушений, таких как конформационные изменения из-за связывания металлов и железа. Главное преимущество этой методики заключается в том, что она требует очень небольшого количества оборудования и результаты можно получить очень быстро. Демонстрировать процедуру будет Маттиас Штайн, аспирант из моей лаборатории.

Для начала с помощью стеклореза на стеклянной пластине разрезайте капилляр из плавленого кремнезема с полиамидным внешним покрытием и внутренним диаметром 50 микрон на длины 33 и 30 сантиметров. С помощью ручки отметьте середину окна обнаружения шириной в один сантиметр на расстоянии 24,5 сантиметра от одного конца капилляра в эксперименте CGE и на расстоянии 21,5 сантиметра от одного конца капилляра в эксперименте ACE. С помощью паяльной лампы сожгите полиамидное внешнее покрытие за 0,5 сантиметра до и после каждой отметки.

Аналогичным образом с помощью паяльной лампы удалите по одному сантиметру покрытия на обоих концах капилляров. Затем с помощью этанола и мягкой салфетки очистите концы капилляров и окна обнаружения. Установите капилляр в систему CE с окном обнаружения рядом с выпускным отверстием.

После приготовления растворов, согласно текстовому протоколу, использовать 250 микромолярный раствор хлорида кальция для наполнения шприца объемом 10 миллилитров. Затем присоедините к шприцу фильтр PVDF толщиной 0,2 микрона и протолкните 2 миллилитра раствора через фильтр, чтобы сбросить его. Используйте оставшийся в шприце хлорид кальция для наполнения 10 флаконов до максимально допустимого объема.

Пометьте каждый флакон как 250 микромолярный раствор раствора хлорида кальция во входном флаконе. Далее, используя раствор хлорида кальция, заполните 10 флаконов наполовину. Отметьте каждый как 250 микромольный раствор раствора хлорида кальция в выходном флаконе.

Затем другими растворами, содержащими металлическую соль, наполните флаконы аналогичным образом. Кроме того, для каждой пары входных и выходных флаконов используйте 30 микромолярный трис-буфер для приготовления аналогичного набора входных и выходных флаконов. Маркером EOF 60 микромолярного ацетанилида заполните 10 флаконов.

Затем используйте раствор образца из расчета один миллиграмм на миллилитр, чтобы заполнить один флакон. После подготовки анализа, в соответствии с текстовым протоколом, провести сепарацию путем гидродинамического впрыскивания раствора образца для экспериментов CGE и подачи 0,1 бар на четыре минуты на входе. Затем подайте отрицательное напряжение 16,5 киловольт и давление 2,0 бар на оба конца капилляра в течение 25 минут.

После подготовки метода для измерений без лигандов подготовьте метод для измерений с лигандами, сначала используя 0,1 молярного раствора ЭДТА для промывания капилляра при давлении 2,5 бар в течение 1 минуты. Затем с помощью деионизированной воды промыть капилляр. Затем уравновесьте капилляр, промыв его с помощью раствора лиганда при давлении 2,5 бар в течение 1,5 минут.

Затем введите раствор ацетанилида с давлением 0,05 бар в течение 6 секунд и замените входной и выходной флаконы на лиганд, содержащий буферные флаконы. Нанесите 0,05 бар на 2,4 секунды, чтобы протолкнуть раствор ацетанилида дальше от кончика капилляра. Подайте напряжение 10,0 киловольт на 6 минут и определите пик ацетанилида на длине волны 200 нанометров.

После промывки капилляра деионизированной водой ЭДТА и раствором лиганда, как и раньше, введите образец белка и замените входной и выходной флаконы на свежие лиганды, содержащие буферные флаконы. Поочередно повторяйте снятие измерений с лигандами и без них. Затем повторите метод, используя растворы щелочноземельных лигандов.

Наконец, используйте следующие решения для выполнения того же метода. Затем рассчитайте изменение соотношений размеров зарядов для различных взаимодействий белковых металлов-ионов. Здесь представлена электроферограмма образца AtHIRD11, полученная в ходе экспериментов CGE.

Размер пептида увеличивается слева направо. Пик номер четыре имеет наибольшую массу и указывает на интактный белок. Меньшие пики, два и три, представляют собой более мелкие примеси.

На этом рисунке представлена электроферограмма для ацетанилида во время экспериментов с АПФ. Раствор ацетанилида показывает только один высокий пик, так как в нем не должно быть примесей. Время обнаружения пикового максимума указывает на время миграции электроосмотического потока и используется для расчета взаимодействия.

Данная электроферограмма образца AtHIRD11 в ходе эксперимента ACE была выполнена в отсутствие SDS и ионов металлов. Помимо двух примесей из электроферограммы CGE, присутствуют как минимум пять пиков, которые связаны с самим белком. Здесь показана графическая оценка измеренных сдвигов во времени миграции в присутствии различных ионов металлов для шестого пика.

Он представлен расчетной величиной Delta R по RF. Каждый результат указывает на то, насколько сильно произошел сдвиг, по его величине и знаку, на который указывает общее изменение заряда ионных комплексов белковых металлов. После освоения техника может быть выполнена для одного партнера по взаимодействию за восемь часов, включая CGE-взаимодействие, если оно выполнено правильно. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости замены белковых растворов для длительных измерений, поскольку продукты распада могут увеличиваться с течением времени, а также о необходимости замены растворов Tris Buffer для получения более точных результатов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как разрезать и очистить капилляр, а также настроить метод аффинного капиллярного электрофореза, чтобы оценить связывающее поведение внутренних неупорядоченных белков.