Устные биопленки на различных материалах для стоматологических имплантатов

Здесь мы представляем протокол для оценки устного биопленки на титана и циркония материалы для абатментов протезирование, включая анализ жизнеспособности клеток бактерий и морфологические характеристики. Модель на месте , связанная с мощными микроскопии методов используется для анализа устного биопленки.

Формирование биопленки полости рта на различных материалах для дентальных имплантатов. Бактериальные биопленки представляют собой сложные, функционально и структурно организованные микробные сообщества, характеризующиеся разнообразием видов микроорганизмов, синтезирующих внеклеточные, биологически активные полимерные матрицы. Зубные имплантаты и их ортопедические компоненты подвержены бактериальной колонизации и образованию биопленки.

Использование материалов с химическим составом и рельефом поверхности, обеспечивающими низкую микробную адгезию, может снизить распространенность и прогрессирование периимплантных заболеваний. Учитывая общую сложность окружающей среды и неоднородность биопленки полости рта, необходимы микроскопические методы, которые могут позволить провести структурный анализ биопленки с поверхностей зубов и стоматологического материала. В данной статье описан ряд протоколов, реализованных для сравнения образования биопленки полости рта на различных материалах для дентальных имплантатов.

Этапы использования биопленки в этом исследовании были следующими:Запись верхнечелюстной дуги с помощью альгинатного оттиска. Залить альгинатный оттиск камнем IV типа, чтобы изготовить модель верхнечелюстной дуги. Изготовьте фиксирующие зажимы из микрохромированной проволоки и расположите их на модели.

Манипулируйте самоотверждаемой акриловой смолой в соответствии с инструкциями производителя и прижимайте акриловую смолу между двумя стеклянными пластинами во время пластической фазы, чтобы получился лист толщиной три миллиметра. Положите акриловый лист на небную область модели, в соответствии с конструкцией устройства, и срежьте излишки акриловой смолы перед полимеризацией. Изготовьте восковые диски с помощью матрицы диаметром 10 миллиметров и толщиной два миллиметра.

Вставьте в акриловую смолу четыре восковых диска, два из них между премолярами, а два других рядом со вторыми молярами. Дайте акриловой смоле полимеризоваться в горшке под давлением под давлением 20 фунтов сжатого воздуха в течение 20 минут. Закончите внутриротовое устройство с помощью электрического наконечника и точек фрезерования и полировки.

Отполируйте поверхности образца наждачной бумагой с водяным охлаждением и снижением абразивности. Очистите образцы жидким моющим средством и водопроводной водой и ультразвуковой ванной изопропиловым спиртом в течение 15 минут. Затем высушите впитывающими бумажными полотенцами.

Зафиксируйте образцы во внутриротовом устройстве с помощью нетоксичного клея-расплава. Установите устройство, содержащее образцы, в ротовую полость. Внутриротовое устройство, содержащее образцы, следует носить в течение 48 часов.

Приготовьте раствор для окрашивания, добавив три микролитра SYTO 9 и три микролитра йодида пропидиума в один миллилитр стерильной дистиллированной воды. Переложите образцы в 24-луночный планшет и тщательно промойте PBS для удаления неадгезивных клеток. Добавьте соответствующий объем раствора флуоресцентного красителя, чтобы покрыть образец, содержащий биопленку.

Добавляйте краситель очень аккуратно, чтобы не дезорганизовать биопленку. Выдержите экземпляр в течение 20-30 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Аккуратно промойте образец биопленки стерильной дистиллированной водой, чтобы удалить излишки красителя.

Поместите образец в чашку со стеклянным дном для анализа биопленки с помощью многофотонной лазерной сканирующей микроскопии. Размер полученных изображений составил 5,16 х 5,16 мм, что соответствует 26,64 квадратным миллиметрам от общей площади каждого экземпляра, или 33,94% от общей площади. Изображения были проанализированы с помощью программного обеспечения Фиджи.

Каждая ячейка была выделена с помощью инструмента выделения, и интенсивность флуоресценции измерялась через интегральную плотность пикселей, вычитая фон изображения. Выберите по три образца каждого испытуемого материала и оцените химический состав в двух разных областях каждого образца с помощью сканирующего электронного микроскопа, соединенного со спектрометром дисперсионной энергии. Закрепите биопленку, погрузив образцы в 2,5% глутаральдегида, разведенного в 0,1 М буфере из какодилата натрия, на 24 часа.

Постирайте в буфере PBS. После фиксации с 1%-ным тетраоксидом осмия в течение одного часа. Постирайте в буфере PBS.

Тщательно обезвоживайте образцы биопленки, погружая их в растворы этанола в возрастающих концентрациях. Перенесите образцы в сушилку для критических точек и сделайте несколько замен углекислым газом, пока образцы не высохнут. Вытащите высушенные образцы из аппарата и установите их на держатели сканирующего электронного микроскопа.

Нанесите покрытие из слоя золота толщиной 20 нанометров на поверхность образца в течение 120 секунд. Колонизационная плотность биопленки после 48 часов роста in situ была представлена в данном исследовании отношением колонизированной площади к титановым и диоксидам циркония по отношению к общей площади сканирования образца с помощью многофотонной микроскопии. На рисунке показаны бактерии, прилипшие к поверхностям испытуемых материалов.

На поверхностях литых и обработанных титановых дисков наблюдалась более высокая плотность биопленки, чем на дисках из диоксида циркония. На этом рисунке показаны живые и мертвые бактерии, прилипшие к поверхности образцов. В этом протоколе йодид пропидиума, окрашенный нуклеиновыми кислотами, проникает только в бактерии с поврежденной мембраной и, следовательно, излучает красный флуоресцентный сигнал, который связан с мертвыми клетками.

SYTO 9 проникает в бактериальные клетки с интактной или поврежденной мембраной и излучает зеленый флуоресцентный сигнал от живых микроорганизмов. Жизнеспособность клеточных бактерий была сходной между исследуемыми материалами с преобладанием живых микроорганизмов во всех группах. Трещины, канавки или дефекты истирания, возникшие в процессе полировки и/или механической обработки, присутствовали на поверхности различных анализируемых материалов.

В дисках из диоксида циркония наблюдались большие участки с отсутствием микроорганизмов и присутствием мелких полиморфных микробных агрегатов, состоящих преимущественно из кокков и бацилл и нитчатых бактерий. Присутствие кокков и бацилл было рассеяно на поверхностях обработанных титановых дисков. Литые титановые образцы представляли собой колонии микроорганизмов, вовлеченных в матрицу, с биопленкообразным видом на поверхности.

На поверхности дисков из диоксида циркония было обнаружено меньше материала матрицы по сравнению с обработанными титановыми и литыми титановыми дисками. Анализ EDS выявил в диоксиде циркония 70,83% диоксида циркония. В литых титановых дисках 95,16% титана, а в обработанных титановых дисках 89,86% титана.

Протокол, описанный в данном исследовании, обеспечил удовлетворительную сохранность биопленки в течение 48 часов, демонстрируя тем самым методологическую адекватность. Использование флюороисточника и обработка изображений с помощью многофотонной микроскопии позволили провести анализ бактериальной целостности в очень гетерогенной популяции микроорганизмов из репрезентативной области данного образца с минимальным клеточным повреждением. Подготовка биологических образцов к электронной микроскопии способствовала структурному сохранению биопленки, что привело к получению изображения с хорошим разрешением и отсутствием артефактов.

Это позволило визуализировать и морфологическую характеристику прилипших микроорганизмов.