Оптимизации лазер захват Microdissection для изоляции кишечных ганглиев от свежемороженые тканей человека

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы об энтеральной нервной системе, такие как профиль экспрессии энтеральных ганглиев в кишечнике взрослого человека. Основное преимущество данной методики заключается в том, что с ее помощью можно получить высокие выходы РНК из кишечных ганглиев человека при максимальном сохранении качества РНК. Начните с разрезанной на 20 сантиметров длины ткани кишечника.

Во-первых, обрежьте жировую и соединительную ткань. Избегайте надрезов серозы, которые могут привести к структурному повреждению миентерального сплетения. Далее сделайте продольный разрез по всей длине обрезанного образца, желательно в месте прикрепления брыжейки.

Затем препарируйте и выбросьте taeniae coli из толстой кишки, чтобы ткань могла выровняться. Теперь разложите кишечник слизистой стороной вниз на охлажденную разделочную доску. Затем нарежьте полоски шириной 1,25 сантиметра по всей длине ткани.

Когда они будут разрезаны, переложите каждый кусок в раствор для хранения охлажденных тканей для временного хранения. Далее разрежьте каждую полоску на сегменты длиной от двух до 1,5 сантиметров. Нарезав полоску на сегменты, промокните сегменты насухо.

Важно, чтобы ткань была очень сухой, чтобы при замораживании на ней не образовывались кристаллы льда. Теперь разложите высушенные кусочки ткани слизистой стороной вверх на холодной, одноразовой пластиковой форме. Затем расплющите каждую деталь с помощью изогнутых щипцов, чтобы удалить захваченные пузырьки воздуха.

Ткани будут расширяться по мере уплощения. После сплющивания сегментов тканей оцените их толщину перед замораживанием. При необходимости сдвиньте края образца внутрь, пока образец кишечника не приблизится к своей первоначальной толщине.

Теперь перенесите загруженную форму основания на суспензию из сухого льда и 2-метилбутана. Ткань должна полностью замерзнуть в течение 30-60 секунд. Затем сразу же высушите дно формы с помощью холодных салфеток, которые были выдержаны на сухом льду.

Теперь проверьте образец. Обратите внимание на все образцы, которые не кажутся плоскими. Затем оберните форму в алюминиевую фольгу, которая была предварительно маркирована и охлаждена перед использованием.

Затем накройте фольгу слоем полиэтиленовой пленки, чтобы свести к минимуму обезвоживание. Держите образцы на льду до тех пор, пока их можно будет хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию. После подготовки необходимых материалов насыпьте трех-пятимиллиметровый холмик TFM на большой держатель для образцов криостата и немедленно перенесите образец кишечника серозной стороной вверх на TFM.

Через несколько секунд при комнатной температуре переложите держатель образца на сухой лед и накройте его порошкообразным сухим льдом. Перед срезом убедитесь, что ТФМ находится ниже плоскости миентерального сплетения. Затем установите держатель образца в головку криостата и совместите образец с лезвием криостата.

Сделайте плоскость миентерального сплетения параллельной режущему лезвию. Теперь сделайте восьмимикронные срезы через серозу и продольную мышцу до достижения миентерального сплетения. Чтобы локализовать миентеральное сплетение, смонтируйте образец и окрасьте его водным красителем, например, 1% кристаллическим фиолетовым.

Чтобы продолжить, определите место соединения между продольным и круговым мышечными слоями. В начале секционирования сероза будет отмечена наличием соединительной ткани. Некоторое количество оставшегося брыжеечного жира также может присутствовать вдоль серозы.

Затем становится видимым лист наружного продольного мышечного слоя Как только будет достигнута граница между продольным и круговым мышечными слоями, будет наблюдаться часть кишечных ганглий. В следующих нескольких срезах миентеральное сплетение станет очень заметным с большими полосами ганглиев в пределах одного участка. Теперь соберите серийные срезы для микродиссекции лазерного захвата.

Охладите PEN в криостате в течение 5-10 секунд и используйте их для крепления секций. В лучших отделах будет много нейронов и глии. Теперь приступайте к окрашиванию, а затем обезвоживайте участки, как описано в текстовом протоколе.

В процессе подготовки вставьте картридж с колпачками LCM в предметный столик микроскопа LCM. Затем загрузите образец слайда в рабочую область и получите обзорное изображение слайда. Определите нужное место для ЛКМ и загрузите колпачок на предметное стекло.

Затем выровняйте инфракрасный лазер и отрегулируйте мощность и продолжительность лазера для точки захвата диаметром от 20 до 30 микрон. Далее наметьте желаемые ганглии, которые нужно собрать. Следите за тем, чтобы оставаться в пределах границы коллекционной области на кепке, которая отображается в виде зеленого круга.

Для каждой из ганглий, очерченных УФ-траекторией резки, отрегулируйте ИК-пятна таким образом, чтобы через каждые 100-500 микрон было по крайней мере одно ИК-пятно, чтобы гарантировать, что все ганглии будут собраны при снятии колпачка с образца. Затем нажмите кнопку IR UV Cut, чтобы продолжить сбор всех отмеченных ганглий. После завершения сбора переместите колпачок на новое место и повторите процесс сбора.

Это можно повторять в течение 60-80 минут. Когда колпачок LCM будет наполнен достаточным количеством ганглиев, перенесите его на станцию контроля качества. Если на колпачке присутствует мусор, сотрите его с помощью кисти с тонким наконечником, которая была подготовлена для использования РНК.

Используйте наконечник для пипетки для удаления трудноудаляемого мусора. Затем закрепите колпачок на пробирке с микрофугой объемом 0,5 миллилитра, заполненной 230 микролитрами буфера для лизиса РНК. Переверните колпачок, кратковременно сделайте его вихрем, а затем инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 30 минут.

Позже центрифугируйте образец в течение пяти минут при давлении 5 000 г или быстрее, а затем перенесите пробирку с микрофугом в сухой лед. Теперь образец готов к экстракции РНК. При вытягивании двух колпачков кишечных ганглиев на образец получалось более одного нанограмма РНК, достаточного для RNA-Seq, и РНК была отличного качества.

Целостность РНК показанного образца составляет 8,3. Также были собраны образцы с числами целостности 7,5 и 6,9. В общей сложности более 95% всех подготовленных образцов были достаточно хороши для RNA-Seq.

Качество наборов данных RNA-Seq оценивали с помощью биоинформатического конвейера. Смещение в конце указывает на то, что образцы были успешно секвенированы и имели лишь скромное смещение в три простых конца. График биотипа гена показывает, что результаты секвенирования были в значительной степени согласованы.

После освоения этого метода его можно использовать для сбора биологических репликатов РНК из кишечных ганглиев достаточного качества и количества для RNA-Seq всего за восемь-12 часов. При попытке выполнить эту процедуру важно, чтобы образцы кишечника человека были заморожены как можно более плоскими. Это гарантирует, что вы сможете собрать очень большие срезы кишечных ганглиев человека, которые быстро и легко обрабатываются с помощью микродиссекции с лазерным захватом.