Оценка функции почек в моделях мыши клубочковых болезни

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области заболевания клубочков относительно функционального и структурного фенотипа клубочка и позволяет провести механистический анализ патологии почек. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть адаптирована ко всем оцениваемым моделям заболевания клубочков. Для оценки соотношения креатинина альбумина в моче поместите одного самца мыши в возрасте от шести до восьми недель в метаболическую клетку для мышей, содержащую воду и питательную диетическую пищу в тихой комнате.

Через шесть часов верните мышей в их обычное жилье и соберите минимум 50 микролитров исходного образца мочи из каждой клетки, повторяя сбор мочи от одного раза в неделю до одного раза в месяц. В конечной точке эксперимента собирают почки из брюшной полости каждого животного и промывают органы в ледяном PBS. Чтобы исследовать корковые клубочки, удалите и нарежьте один полюс коры почек на кусочки размером в один кубический миллиметр.

Чтобы осмотреть глубокие юкстамедуллярные клубочки, удалите и нарежьте небольшой участок мозгового вещества кубиками на кусочки размером в один кубический миллиметр. Затем поместите фрагменты с каждого участка ткани в отдельные флаконы для электронной микроскопии, содержащие пять миллилитров 2,5% раствора глутаральдегида, и храните образцы при температуре четыре градуса Цельсия. Для гистологии корковых и юкстамедуллярных клубочков удалите и зафиксируйте верхнюю треть почки в пяти миллилитрах 4% параформальдегида при четырех градусах Цельсия на 24 часа.

Затем перенесите неподвижную ткань в пять миллилитров 70% этанола на 24 часа, прежде чем погрузить в парафин. Для иммунофторхимического анализа корковых и медуллярных клубочков поместите треть почки в тканевую форму и погрузите ткань в смесь с оптимальной температурой резки. Затем поместите форму на сухой лед, пока соединение не замерзнет, и храните образцы при температуре 80 градусов Цельсия, пока они не будут разрезаны.

Для анализа белка поместите три на два кубических миллиметра кусочков коры головного мозга почек в пластиковые пробирки объемом 0,5 миллилитра и заморозьте образцы в жидком азоте для хранения при температуре 80 градусов Цельсия. Для долгосрочного хранения тканей для анализа РНК, после мгновенного замораживания трех на два кубических миллиметра почек, как только что было продемонстрировано, добавьте пять объемов раствора для стабилизации РНКазы для хранения при температуре 80 градусов Цельсия. Для выделения клубочков срежьте оставшуюся ткань почек и поместите кусочки ткани в пять миллилитров раствора млекопитающего Рингера с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина, или БСА, на лед для немедленного просеивания.

Чтобы изолировать клубочки, уложите сита с возрастающими размерами пор на стеклянный стакан и поместите срезы почек на верхнее сито размером пор 425 микрон. Затем используйте поршень шприца и свежий ледяной раствор для млекопитающих, дополненный 1% BSA, чтобы протереть почечную ткань через первое сито. По мере того, как кусочки почек проталкиваются, снимите верхнее сито и продолжайте проталкивать фрагменты почек через каждое сито по очереди.

Когда останутся только сита 100 и 70 микрон, переложите клубочковый урожай, удерживаемый последними двумя ситами, в 50-миллилитровую коническую пробирку с 10 миллилитрами свежего раствора млекопитающих, дополненного 1% БСА на льду. Разделите три миллилитра суспензии клубочков между двумя 1,5-миллилитровыми микроцентрифужными пробирками и гранулируйте клубочки методом центрифугирования. После удаления надосадочной жидкости мгновенно заморозьте клубочки в жидком азоте при температуре 80 градусов Цельсия для последующего извлечения белка и РНК.

Затем поместите оставшийся раствор клубочков в водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия для инъекции в установку для клубочковой водопроницаемости на предметном столике для светового микроскопа. После захвата интактного отдельного клубочка освободить капсулу Боумена и фрагменты трубчатых трубочек с помощью микропипетки, начать запись и перфузировать клубок свежим раствором Рингера с добавлением 1% БСА. Через 30 секунд переключите перфузат на концентрированный 8% раствор БСА.

После 10 секунд перфузии переключите перфузат обратно на 1%-ный раствор БСА и остановите запись. Для детальной визуализации клубочковых клеток и остаточного матрикса высушите фиксированные, залитые парафином образцы коры головного мозга почек при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, после чего следует депарафинизация с последовательным погружением ксилола и нисходящего этанола. Регидратируйте образцы в дистиллированной воде в течение пяти минут и инкубируйте предметные стекла в периодическом растворе кислоты в вытяжном шкафу.

Через пять минут промойте предметные стекла тремя пятиминутными промывками в 100 миллилитрах дистиллированной воды, после чего проведите 15-минутную инкубацию в реагенте Шиффа. В конце инкубации промойте предметные стекла в проточной воде из-под крана в течение пяти минут и смешайте с гематоксилином в течение трех секунд, а затем тщательно промойте в проточной воде из-под крана еще на 15 минут. Затем обезвоживайте слайды с помощью восходящих погружений этанола и двух последовательных трехминутных погружений в ксилол.

После сушки на воздухе предметные стекла могут быть смонтированы с помощью монтажного носителя на основе ксилола для оценки их клубочковой структуры на световом микроскопе с 400-кратным увеличением. У мышей с нокаутом фактора эндотелия сосудов, или VEGF-A, развивается прогрессирующая альбуминурия к 10 неделям, по сравнению с контрольной группой из помета дикого типа, в то время как нокаутные животные с гиперэкспрессией VEGF165b защищены от этого состояния. Мыши с нокаутом VEGF-A имеют значительно повышенную клубочковую водопроницаемость по сравнению с контрольной группой дикого типа, что частично спасается сверхэкспрессией VEGF-A165b.

Периодическое кислотное окрашивание по методу Шиффа срезов коры головного мозга почек у мышей с нокаутом VEGF-A не выявило структурных аномалий клубочков при анализе световой микроскопии. Однако при анализе методом электронной микроскопии у нокаутных мышей наблюдается увеличение ширины базальной мембраны клубочков, уменьшение числа эндотелиальных фенестр, уменьшение охвата субподоцитарного пространства и увеличение средней ширины подоцитарной щели, в то время как среднее количество щелей осталось неизменным. Сверхэкспрессия VEGF165b у животных с нокаутом VEGF-A спасает изменения в базальной мембране клубочков и ширине щели.

Тем не менее, сверхэкспрессия VEGF165b не влияет на измененную численность фенестр или покрытие субподоцитарного пространства. РНК, выделенная из просеянных клубочков, подтверждает экспрессию мРНК VEGF165b человека у мышей с гиперэкспрессией VEGF165b, коррелируя со снижением экспрессии VEGFR2 у мышей с нокаутом VEGF-A, которое спасается сверхэкспрессией VEGF165b в нокауте у животных. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как провести полное обследование почек для оценки мышиной модели клубочкового заболевания, включая оценку клубочковой проницаемости как для альбумина, так и для воды.