Холерный вибрион колонизации и диарея в модели для взрослых рыбок данио

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области холерного вибриона, например, как холерный вибрион колонизируется на Тихом побережье и конкурирует с кишечной микробиотой, чтобы занять свою нишу. Основное преимущество этого метода заключается в том, что рыбы являются естественными хозяевами холерного вибриона, поэтому мы можем изучить полный жизненный цикл холерного вибриона. Демонстрировать процедуру будут Дхрубаджьоти Наг, постдок из моей лаборатории, и Пол Брин, аспирант из моей лаборатории.

После приготовления культур V.cholerae прививайте данио-рерио методом погружения. Сначала поместите четырех или пяти рыбок данио в стакан объемом 400 миллилитров, содержащий 200 миллилитров стерильной инфекционной воды. Затем добавьте один миллилитр культуры V.cholerae для достижения желаемой концентрации инфекции.

Затем накройте стакан перфорированной крышкой. После подготовки всех стаканов перенесите их в стеклянный передний инкубатор, установленный на 28 градусов Цельсия Для временного воздействия, примерно через шесть часов, вылейте воду из стакана через сетку, чтобы собрать рыбу. Зараженная вода должна быть утилизирована в отбеливателе, чтобы убить бактерии.

Затем поместите рыбок в 200 миллилитров стерильной инфекционной воды на пять минут. Через пять минут пропустите эту воду через сетку, смешав воду с хлоркой. Теперь рыбки могут заходить в новый чистый стакан с 200 миллилитрами стерильной инфекционной воды.

Когда эксперимент достигнет желаемой конечной точки, возьмите пробу 15 миллилилитров инфекции воды для диагностических целей. Затем соберите рыбу и утилизируйте зараженную воду соответствующим образом. Ориентируйте брюшную сторону вверх и закрепите тело булавкой через нижнюю челюсть и еще одним булавкой сразу за анальным отверстием.

Наклоните оба штифта в сторону от корпуса. Далее протрите брюшную поверхность рыбы 70% этанолом. Затем простерилизуйте скальпель и ножницы Vannas, используя 70% этанол и пламя.

Теперь с помощью скальпеля сделайте небольшой продольный надрез в области живота, который проникает в чешуйки, но разрез только до глубины кожи. Далее ножницами осторожно продлите разрез по длине тела, разрезая не глубже уровня кожи. Избегайте разрезания анального отверстия.

Затем сделайте два боковых надреза по направлению к голове, чтобы расширить отверстие. Затем прикрепите кожу с каждой стороны боковых разрезов к поверхности рассечения, наклонив штифты наружу, в сторону от тела. Теперь кишечный тракт должен быть виден в виде очень тонкой, бледной трубки.

Теперь с помощью двух пар стерилизованных пламенем щипцов осторожно удалите весь кишечный тракт, который может быть довольно хрупким. Перенесите ткань в гоминизирующую трубку, содержащую стеклянные шарики и один миллилитр холодного буфера. Затем гомогенизируйте ткани, как описано в текстовом протоколе, и количественно оцените уровни колонизации кишечника.

Далее производят серийные разведения кишечного гомогената и буфера. Для каждой рыбы приготовьте пять-шесть десятикратных разведений в одном миллилитре объемов. Закрутите трубки для смешивания.

Затем нанесите от 100 до 200 микролитров каждого разведения на LB агаровые планшеты, содержащие стрептомицин и X-gal. Инкубируйте пластины при температуре 30 градусов Цельсия в течение 16-18 часов. После ночной инкубации подсчитайте колонии V.cholerae на планшетах.

Эти бактерии обычно образуют бледно-голубые колонии на LB-среде с X-gal. Если наблюдается несколько морфологий колоний, нанесите несколько колоний с каждой другой морфологией на другую пластину TCBS. На TCBS V.cholerae образует большие, слегка сплющенные желтые колонии с непрозрачными центрами и полупрозрачными перифериями.

Чтобы определить уровень муцина при диарее у рыб, проведите анализ на 96 луночном планшете. В трех экземплярах загрузите в лунки по 100 микролитров зараженной воды для каждого условия испытания, включая холостую. Затем смешайте 50 микролитров свежего 0,1%-ного раствора кислоты периодического действия в каждую тестовую лунку.

Для перемешивания используйте пипетку. Далее плотно заверните тарелку в полиэтилен и выдержите тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-полутора часов. После инкубации остудите тарелку до комнатной температуры.

В каждую лунку добавьте по 100 микролитров раствора Фуксина и смешайте с пипеткой. Теперь снова оберните тарелку и поставьте ее на коромысло при комнатной температуре. Примерно через 20 минут считайте показания пластины с точностью до 560 нанометров с помощью считывателя пластин.

Для количественной оценки реакции, вызванной муцином в растворе. Чтобы измерить уровень белка при диарее у рыб, используйте тест Брэдфорда. Смешайте 66 микролитров одного из стандартов BSA или 66 микролитров инфекционной воды с 1 000 микролитров реагента для анализа Брэдфорда в одноразовой кювете.

Теперь инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение двух минут. А затем считывать поглощение на 660 нанометрах на спектрофотометре. Простой метрикой для величины диареи является мутность в воде, измеренная на уровне 600 нанометров.

Хорошо перемешайте воду, добавьте один миллилитр в одноразовую кювету и снимите мерку. Для базового, пустого измерения используйте чистую инфекционную воду. Также можно измерить количество выделяемых бактерий V.cholerae.

Это можно сделать с рыбами, которые были перемещены в чистую воду после прививки. Делайте последовательные разбавления аликвата воды в баке, как описано ранее. Затем разбавьте разбавленные жидкости на селективных средах и инкубируйте планшеты при температуре 30 градусов Цельсия в течение 24 часов.

Позже подсчитайте колонии, как описано выше, а затем определите КОЕ. Группы рыбок данио, размещенных в 200 миллилитрах воды, были привиты пятью миллионами КОЕ от пандемической холеры. После шести часов в зараженной бактериями воде рыбы переходят в чистую воду на 18 часов.

Затем были собраны воздушные кишки. Каждая рыба содержала от 100 000 до 1 000 000 клеток V.cholerae. Зараженная вода использовалась для других анализов.

Уровни муцина были выше, когда инфекционные дозы были выше. OD600 в воде был значительно выше, когда рыба была заражена V.cholerae. Наконец, общий уровень белка в воде инфицированных рыб был почти в два раза выше, чем в воде неинфицированных рыб.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как заразить взрослых рыбок данио холерным вибрионом и количественно оценить диарею, вызванную инфекцией. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализы передачи, для оценки инфицирования наивных рыб ранее инфицированными рыбами.