Одной молекулы флуоресценции In Situ гибридизация (smFISH) анализ многообещающий вегетативного роста дрожжей и мейоз

Общая цель этой оптимизированной одномолекулярной РНК-гибридизации in situ, или smFISH, заключается в обнаружении и количественном определении отдельных молекул РНК на клеточном уровне во время вегетативного роста и мейоза почковающихся дрожжей. Этот метод выявляет межклеточную изменчивость экспрессии генов при локализации субклеточной РНК и, следовательно, является мощным методом изучения регуляции генов. Помимо уникальной информации, которая может быть раскрыта с помощью smFISH, основное преимущество метода заключается в том, что после оптимизации он надежен и легко воспроизводим.

Для демонстрации этого протокола будет использована мейотическая культура. Чтобы закрепить культуру в 3%-ном формальдегиде, добавьте 1840 микролитров культуры к 160 микролитрам 37%-ного формальдегида в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Переверните примерно пять раз, чтобы перемешать.

Поместите трубку на роликовый барабан при комнатной температуре на 20 минут. Через 20 минут продолжайте фиксацию при температуре четыре градуса Цельсия с вращением на ночь. На следующий день подготовьтесь к перевариванию, сначала разморозив 200 миллимолярных ванидилрибонуклеозидных комплексов, или VRC, при температуре 65 градусов Цельсия в течение не менее 10 минут.

Для приготовления мастер-смеси для дигезирования сначала пипеткой 2125 микролитров буфера В в пробирку объемом 15 миллилитров. Затем сделайте теплый VRC вихревым в течение пяти секунд, чтобы полностью суспендировать его, и добавьте 200 микролитров VRC в 15-миллилитровую трубку. Смесь должна получиться светло-коричневато-зеленого цвета.

Центрифугируйте мейотический образец при температуре 21 000 x g в течение полутора минут при комнатной температуре. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, расположив вакуумный наконечник на противоположной стороне гранулы, чтобы не потревожить гранулу. Ресуспендируйте клетки в полутора миллилитрах холодного буфера В путем пипетирования вверх и вниз для смешивания.

Центрифугируйте при 21 000 х г в течение полутора минут. Удалите основную массу жидкости методом вакуумной аспирации, оставив после себя около 100 микролитров. Повторно суспендируйте клетки в полутора миллилитрах холодного буфера В. Центрифугируйте образцы, удалите жидкость и снова суспендируйте клетки в полутора миллилитрах холодного буфера В.

Центрифугируйте при 21 000 х г в течение полутора минут. Полностью отасуньте жидкость с помощью пипетирования. Ресуспендируйте клетки в 425 микролитрах пищеваренной мастер-смеси и сделайте вихрь на короткое время.

Добавьте в тюбик пять микролитров зимолазы и завихрите в течение двух-трех секунд для перемешивания. Поместите трубку на роликовый барабан и варите при температуре 30 градусов Цельсия в течение 15-30 минут. Через 15 минут проверяйте клетки с помощью микроскопии каждые пять минут и останавливайте пищеварение, когда около 80% клеток кажутся непрозрачными и нерефракционными.

Центрифугируйте пробирку при давлении 376 x g в течение трех минут. Удалите надосадочную жидкость полностью. Аккуратно ресуспендируйте клетки одним миллилитром буфера В, пипетируя вверх и вниз один-два раза, чтобы перемешать.

Центрифугируйте пробирку и снимите буфер. Аккуратно ресуспендируйте клетки в одном миллилитре 70% этанола и инкубируйте при комнатной температуре в течение трех с половиной или четырех часов. Чтобы начать процедуру гибридизации, центрифугируйте пробирку с клетками при давлении 376 х g в течение трех минут.

Удалите 500 микролитров 70%-ного этанола из тюбика. Аккуратно проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы восстановить суспендию оставшихся клеток и перенести клетки в трубку с низкой адгезией. Перенос образца в пробирку с низкой адгезией имеет решающее значение для предотвращения избыточной потери клеток во время последующих промывок формамидом.

Центрифугируйте трубку с низкой адгезией и удалите весь этанол. Добавьте один миллилитр 10%-ного буфера для промывки формамида в пробирку и аккуратно пипетируйте вверх и вниз два-три раза, чтобы восстановить суспендию клеток. Дайте клеткам застыть при комнатной температуре в течение примерно 20 минут во время приготовления гибридизационных растворов, как описано в текстовом протоколе.

Центрифугируйте образец и удалите надосадочную жидкость в опасные отходы. Добавьте в пробирку не менее 50 микролитров каждого раствора для гибридизации и перемешайте пробирку. Выдерживайте при температуре 30 градусов Цельсия на роликовом барабане не менее 16 часов в темноте.

Когда гибридизация будет завершена, поместите трубку с клетками в коробку, покрытую фольгой, для защиты от света. Центрифугируйте образец при давлении 376 x g в течение трех минут. Удалите надосадочную жидкость в опасные отходы с помощью пипетирования.

Повторно суспендируйте образец в одном миллилитре буфера для промывки из 10% формамида, осторожно пипетируя вверх и вниз два-три раза. Поместите пробирку с клетками обратно в коробку, покрытую фольгой, чтобы защитить от света, и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение 30 минут. Через 30 минут центрифугируйте образец.

Удалите надосадочную жидкость в опасные отходы с помощью пипетирования, оставив около 50 микролитров. Повторно суспендируйте образец в одном миллилитре раствора DAPI, аккуратно пипетируя вверх и вниз два-три раза. Еще раз поместите трубку с клетками в коробку, застеленную фольгой, и выдерживайте при температуре 30 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Центрифугируйте образец и полностью удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования. Для образцов, которые не будут визуализированы сразу, повторно суспендируйте гранулу в 50 микролитрах буфера GLOX без ферментов. Перемешайте пипеткой вверх и вниз три-четыре раза.

Держите в коробке, покрытой фольгой, при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока не будете готовы к изображению. Для образцов, которые визуализируются немедленно, добавьте от 15 до 20 микролитров буфера GLOX с ферментами. Нанесите пипетку объемом пять микролитров на защитное стекло и наденьте защитное стекло на предметное стекло.

Поместите лабораторную салфетку на верхнюю часть предметного стекла, где находится защитный колпачок. Аккуратно надавите на салфетку, чтобы закрепить слайд. Поместите предметное стекло в коробку, накрытую алюминиевой фольгой, для переноса в комнату для микроскопа.

Этот протокол был использован для изучения экспрессии гена NDC80, который экспрессирует две изоформы мРНК. Изоформа длинного нерасшифрованного транскрипта имеет 5 простых расширений на 400 пар оснований по сравнению с короткой изоформой. Было разработано два комплекта зондов.

Набор CF 590 связывается с уникальной пятью простыми областями длинной изоформы, а набор Q 670 связывается с общей областью обеих изоформ. В оптимизированных условиях были четко определены отдельные пятна smFISH для обоих наборов зондов. Два набора зондов были использованы для изучения экспрессии NDC80 во время вегетативного роста и мейоза.

В вегетативных клетках был обнаружен устойчивый сигнал от набора зондов Q 670, но не от набора зондов CF 590. Напротив, устойчивый сигнал от обоих наборов зондов был обнаружен в мейотической профазе, и большинство пятен имели колокализованный сигнал. Анализ методом Нозерн-блоттинга подтвердил, что длинная изоформа экспрессируется именно в мейозе.

Было обнаружено, что вегетативные клетки имеют медиану в пять коротких изоформных транскриптов на клетку, тогда как в мейотических профазных клетках медиана значительно снизилась до четырех транскриптов на клетку. В мейотической профазе среднее количество длинных изоформных транскриптов на клетку составляло 21, и 100% клеток экспрессировали транскриптов. После освоения этой техники ее можно выполнить за 72 часа, если она выполнена правильно.

При выполнении этой процедуры важно сначала оптимизировать продолжительность разложения и концентрацию зондов smFISH, необходимых для достижения оптимального соотношения сигнал/шум. Кроме того, не забывайте добавлять VRC во время пищеварения и ночной гибридизации, чтобы предотвратить активность нуклеазы. Благодаря этой разработке этот метод проложил путь исследователям к изучению динамической регуляции генов и локализации субклеточной РНК.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять одномолекулярную РНК FISH при почковающемся мейозе дрожжей.