Обнаружение антител, которые нейтрализуют клеточного поглощения фермента терапии с Cell-based Assay

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммуногенности и биоанализа о влиянии нейтрализующих антител на безопасность препарата, эффективность, фармакокинетический и фармакодинамический профили. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает чувствительный и биологически значимый клеточный метод измерения специфических для лекарственного препарата нейтрализующих антител полуколичественным образом. В этом методе меченые флуорофорами ферменты проникают в клетки Jurkat через связывание остатка маннозы-6-фосфата с независимым от катионов рецептором маннозы-6-фосфата или CI-M6PR.

Нейтрализующие антитела, препятствующие взаимодействию ферментных рецепторов, вызывают снижение флуоресценции, измеряемое с помощью проточной цитометрии. Для начала высейте 7,5 раз по 10-4 клеток Юрката по 100 микролитров питательной среды для клеток на лунку в 96-луночный планшет для культивирования клеток с круглым дном для 14-20-часовой инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе при влажности 95%. Сначала разведите образцы анализа в среде, не содержащей сыворотки, в соотношении один к 2,5.

Затем добавьте по 60 микролитров каждого образца в соответствующие лунки 96-луночного белого круглого дна из полипропиленовой пластины с круглым дном. Это и будет образец инкубационной тарелки. Для образцов, которые дали положительный результат скрининга и нуждаются в подтверждении, сделайте вихревой пузырь с ферментозаместительной терапией или бусинами ФЗТ и добавьте соответствующее количество шариков в коническую пробирку объемом 15 миллилитров для еще одного вортексинга.

Затем поместите трубку в магнитный штатив для трубок на две минуты и осторожно удалите надосадочную жидкость. После четвертой промывки добавьте 100 микролитров шариков в соответствующие лунки новой белой 96-луночной круглой нижней необязывающей полипропиленовой пластины. Когда все бусины будут покрыты, поместите пластину на 96-луночный магнит с боковой юбкой и дайте бусинам образовать гранулу, прежде чем осторожно удалить прозрачную надосадочную жидкость.

Далее добавьте по 140 микролитров каждого образца в соответствующие лунки и запечатайте пластину полиэтиленовой пленкой для встряхивания в течение не менее 60 минут на ротационном вибростенде со скоростью примерно 800 об/мин при комнатной температуре. Затем поместите подтверждающую пластину на 96-луночный магнит с боковой юбкой, чтобы позволить шарикам образовать еще одну гранулу, и добавьте 60 микролитров образца в соответствующие лунки инкубационной пластины из полипропилена с белым круглым дном на 96 лунок. Для образцов, которые были проверены и подтверждены положительными результатами, может быть выполнен титровый ряд.

Для приготовления титрового ряда последовательно разводят образец в объединенной матрице достаточное количество раз, чтобы пересечь заданную точку среза титра, и добавляют 60 микролитров каждого разведенного образца в соответствующие лунки инкубационного планшета для образца и 60 микролитров соответствующих концентраций меченной флуорофором ЭРТ в соответствующие лунки новой 96-луночной белой безсвязной полипропиленовой пластины с круглым дном в соответствии с текстовым протоколом. Затем несколько раз пипеткой смешайте раствор образца флуорофора ERT и заверните пластины в фольгу для 14-20-часовой инкубации при температуре от двух до восьми градусов Цельсия. На следующее утро согрейте планшеты с образцами в ванне с шариками при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10-15 минут и проверьте пластинчатые клетки на перевернутом микроскопе, чтобы убедиться, что клетки здоровы и равномерно распределены по лункам.

Когда планшеты нагреются, добавьте 100 микролитров образца и меченной флуорофором смеси ERT в клеточную пластину в соответствии с картой экспериментального планшета и верните клетки в инкубатор для клеточных культур еще на три часа 15 минут. В конце инкубации гранулируйте клетки методом центрифугирования и подтвердите наличие гранулы на дне каждой лунки. Держа планшет под углом от 30 до 45 градусов, осторожно удалите надосадочную жидкость в каждой лунке, не нарушая гранулы, и трижды промойте ячейки в 200 микролитрах DPBS на лунку за центрифугирование.

После последней промывки добавьте в каждую лунку по 100 микролитров морилки от живых мертвецов для 15-минутной инкубации при комнатной температуре в темноте. В конце инкубации гранулируйте клетки центрифугированием и промойте клетки 200 микролитрами DPBS на лунку. Суспендируйте промытые гранулы в 100 микролитрах от двух до восьми градусов Цельсия 1% параформальдегида на лунку и запечатайте пластину для мягкого импульсного вихря.

Затем заверните тарелку в фольгу для 10-минутной фиксации при температуре от двух до восьми градусов Цельсия. Чтобы проанализировать жизнеспособность клеток с помощью проточной цитометрии, смешайте клетки с 50 микролитрами DPBS на лунку для получения одиночной клеточной суспензии и считайте клетки на проточном цитометре в соответствии со стандартными протоколами проточной цитометрии. Поглощение флуорофорной конъюгированной ФЗТ может быть затем оценено в соответствии со средней интенсивностью флуоресценции или MFI живых одиночных клеток.

Перед проведением испытания в анализе рассчитывается экспериментальная точка отсечения скрининга в качестве порога для определения положительных и отрицательных образцов. В этом примере показан контроль качества с высоким или низким содержанием нейтрализующих антител. Положительные образцы затем проверяются в подтверждающем анализе с использованием магнитных шариков, сопряженных с лекарственными препаратами, чтобы истощить специфические антитела к препарату из образцов.

Образцы с коэффициентом извлечения, превышающим подтверждающую точку разреза, считаются положительными. Образцы, которые прошли скрининг и подтвердили положительный результат, серийно разбавляются и тестируются в титровом анализе для определения относительного титра нейтрализующих антител в каждом образце. Титр — это интерполированное значение между двумя разведениями, которые пересекают точку среза титра.

На рисунке показано, как живые одноклеточные МФИ оценивали поглощение флуорофорной конъюгированной ФЗТ. Например, в этом эксперименте матрица, заряженная положительным контрольным антителом, ингибировала поглощение флуорофора, конъюгированного с ФЗТ, что приводило к низкой медианной интенсивности флуоресценции. Напротив, клетки, инкубированные с матриксом в отсутствие положительного контрольного антитела, демонстрировали более высокую медианную интенсивность флуоресценции, демонстрируя поглощение конъюгированной флуорофором ФЗТ.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о соблюдении строгих инкубационных окон для получения надежных и стабильных результатов. Также важно оптимизировать анализ для каждой ферментозаместительной терапии. После своего развития этот метод проложил путь для ученых в области иммуногенности и биоанализа в области разработки лекарств для изучения влияния нейтрализующих антител на захват клеток на безопасность и эффективность ФЗТ.

Не забывайте, что работа с человеческими образцами может быть чрезвычайно опасной, и что все образцы следует обрабатывать так, как будто они потенциально заразны во время выполнения этой процедуры.