Оптогенетика идентификация типа нейронов с Optrode стекла в бодрствовать мышей

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как функции различных типов нейронов. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она дает возможность достоверно идентифицировать различные типы нейронов in vivo с помощью недорогих и доступных материалов. Я продемонстрирую процедуру вместе с Синдзи Мурамото, нашим техником, и Ланлан Ма, нашим доцентом из нашей лаборатории.

Чтобы начать эту процедуру, аккуратно вытащите стальную трубку для регулировки давления из ствола держателя. Расширите отверстие со стороны гнезда штифта в цилиндре держателя путем сверления. Затем поместите в отверстие трубу из нержавеющей стали.

Далее вставьте в отверстие керамическую разъемную ответную втулку для наконечника диаметром 2,5 миллиметра. Проделайте отверстие в Г-образном кролике и прикрепите к кролику ствол электрододержателя с помощью эпоксидного клея. Впоследствии прикрепите его к манипулятору с помощью винтов.

Подготовьте изготовленную на заказ головную стойку, сделав с помощью фрезы столбчатую распорку печатной платы в прямоугольной форме, и разрежьте ее на две головные стойки с помощью пилы. Затем разровняйте нижнюю часть головной стойки с помощью фрезы. Перед операцией простерилизуйте все хирургические инструменты и головной столб с помощью автоклава.

Очистите стереотаксическую рамку и грелку 70-процентным спиртом. Далее обезболите мышь и поместите ее в стереотаксическую рамку на грелку. В данном эксперименте используется трансгенная мышь, у которой тормозные нейроны экспрессируют канал родопсин-II.

Поместите зубы в отверстие прикусочной планки и слегка затяните носовой зажим. Впоследствии зафиксируйте обе стороны головы с помощью ушных планок. Когда голова будет правильно зафиксирована ушными планками, затяните носовой зажим

Нанесите на глаза офтальмологическую мазь. Подстригите волосы над головой маленькими ножницами и очистите кожу головы ватным тампоном с хлоргексидина глюконатом. Затем разрежьте кожу головы по средней линии и отодвиньте ее в сторону.

Удалите надкостницу ватным тампоном, смоченным в 70-процентном спирте, и дайте черепу высохнуть. Затем прикрепите к манипулятору головной столб. Расположите головную стойку на черепе вокруг брегмы с помощью манипулятора.

Смешайте четыре капли мономера, одну каплю катализатора и одну маленькую ложку полимера на небольшой тарелке, которая охлаждается в холодильнике. Нанесите стоматологический цемент на лобную и теменную кость и зафиксируйте головной столб к черепу. После того как стоматологический цемент затвердеет, снимите мышь со стереотаксической рамки.

Нанесите мазь с антибиотиком на открытые участки кожи и введите коктейль из антагониста медетомидина и антибиотика. Затем поместите мышь на грелку в клетку, пока она не придет в себя, и верните ее в вольерку с обогащениями. Чтобы выполнить трепанацию черепа над целевой областью мозга для записи, очистите череп ватным тампоном, смоченным хлоргексидина глюконатом и 70 процентами спирта.

Осторожно соскребите череп над местом записи с помощью стоматологической бормашины. Когда косточка станет достаточно тонкой, разрежьте ее кончиком скальпеля и извлеките. Затем нанесите стоматологический цемент вокруг открытой области с целью укрепления черепа.

Покройте открытую область мозга силиконовым клеем после того, как стоматологический цемент затвердеет. Затем поместите животное на грелку в клетку, пока оно не придет в себя, и верните его в вольер. Дайте животному восстановиться в течение как минимум одного дня после трепанации черепа, прежде чем выполнять электрофизиологическую регистрацию.

Перед проведением электрофизиологической регистрации сделайте несколько стеклянных пипеток из капилляров из боросиликатного стекла с помощью электродного съемника. Наполните пипетки 10 миллимолярными PBS. В некоторых записях к 10 миллимолярным PBS добавляется два процента нейробиотина.

Далее поместите животное в камеру записи. Прикрепите наполненную стеклянную пипетку к изготовленному на заказ держателю для оптрода. Вставьте проволоку, покрытую хлоридом серебра, в стеклянную пипетку.

После этого подключите контакт к головному каскаду записывающего усилителя. Затем подсоедините волоконно-оптический патч-корд с циркониевым наконечником к разъемной ответной втулке на держателе оптрода. Вставьте патч-корд в рукав до тех пор, пока кончик наконечника не соприкоснется с тыльной стороной стеклянной пипетки.

Патч-корд подает свет от светодиода, который управляется одноканальным светодиодным драйвером. После этого удалите силиконовый клей над трепанацией черепа. Периодически наносите теплый физиологический раствор на поверхность мозга, чтобы предотвратить высыхание поверхности мозга во время сеанса записи.

При необходимости удалите твердую мозговую оболочку острым пинцетом. Здесь спайковые реакции были зарегистрированы в нижнем колликулусе мышей с бодрствующим каналом VGATRHODOPSIN-II. В нижнем колликулусе мышей VGAT-каналродопсин-II ГАМКергические нейроны специфически экспрессируют каналродопсин-II.

У бодрствующих мышей ГАМКергические и глутаматергические нейроны возбуждались или подавлялись соответственно, когда им давали световые стимулы. Когда световой стимул доставляется через стеклянный электрод, он вызывает спайковые реакции в некоторых нейронах. Напротив, в других нейронах световые стимулы подавляли спайковые реакции, вызванные звуковыми стимулами.

Эти результаты показывают, что стеклянный оптрод может регистрировать хорошо изолированную активность одиночной единицы и надежно стимулировать регистрируемые нейроны светом. После разработки этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению того, как различные типы нейронов работают в нейронной лунке различных областей мозга.