На основе биотина пулдаун Assay для проверки mRNA цели сотовой адаптивной

Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы в области биологии мРНК, такие как может ли предсказанная мишень мРНК in silico напрямую взаимодействовать с конкретной клеточной микроРНК. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он использует биотинилированные мимики для снижения целевой мРНК. И эти биотинилированные мимики имеют заблокированные нуклеиновые кислоты или химию на основе LNA, что помогает в образовании очень стабильных олигонуклеотидов с очень высокой аффинностью, которые могут повысить специфичность реакции.

Смысл этой методологии заключается в том, что она может перейти от понимания биологии микроРНК к терапии на основе микроРНК. В основном это связано с тем, что мы все знаем, что микроРНК играют важнейшую роль во всех аспектах клеточной биологии. Таким образом, определив мишени микроРНК, то есть мРНК, мы, безусловно, можем предоставить критически важные знания, которые будут важны для открытий и терапии.

Демонстрировать протокол будет Сабьясачи Даш, аспирант нашей лаборатории. Чтобы покрыть магнитные бусины стрептавидином, сначала тщательно закрутите бусины, чтобы они сгорели. Затем перенесите 30 микролитров ресуспендированных гранул в двухмиллиметровую микропробирку без нуклеаз.

Оставьте наполненную магнитной суспензией трубку на магните на две минуты. Через две минуты удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки, когда шарики притянутся к той стороне трубки, которая соприкасается с магнитом. Затем добавьте в бусины 100 микролитров буфера для стирки.

После добавления буфера для промывки снимите трубку с магнита. Затем закрутите бусины на 15 секунд, чтобы постирать их. Затем перенесите трубку с магнитными шариками на магнит на две минуты.

После окончания инкубации измельчите надосадочную жидкость и выбросьте ее. Затем добавьте в гранулы 100 микролитров раствора, освобождающего РНКазу. Перемешайте шарики в течение 15 секунд, чтобы смешать раствор РНКазы.

Затем выдержите бусины при комнатной температуре в течение пяти минут. После пяти минут инкубации перенесите трубку с магнитными шариками на магнит на две минуты. После инкубации отпишьте надосадочную жидкость и выбросьте ее.

Далее добавьте в бусины 100 микролитров раствора для ресуспензии, и вортексируйте в течение 15 секунд. После вортекса выдержать трубку при комнатной температуре в течение пяти минут. Через пять минут перенесите трубку с магнитными шариками на магнит на две минуты.

Через две минуты издайте надосадочную жидкость и выбросьте ее. Далее добавьте в бусины 200 микролитров раствора для блокировки шариков. Чтобы снова суспендировать шарики в блокирующем растворе, тщательно перебейте его при комнатной температуре в течение 15 секунд.

Затем оставьте трубку на вращателе с несколькими трубками при температуре четыре градуса Цельсия на 16 часов. Чтобы приготовить лизат, используйте скребок для клеток и соскребите трансфицированные HEK293T клеток под ламинарный колпак. Затем перенесите клеточную суспензию в двухмиллилитровую микрофуговую пробирку.

Затем подвергните клеточную суспензию центрифугированию при плотности 1,500г в течение пяти минут. После центрифугирования растворите клеточную гранулу в 1x фосфатно-солевом буфере при поддержании pH 7,2. Повторите процесс центрифугирования, чтобы получить остаточную гранулу без среды.

После того как центрифугирование закончится, быстро переложите гранулу на лед. Далее приготовьте свежий буфер для лизиса клеток. После приготовления буфера добавьте 260 микролитров буфера для полного лизиса клеток к образцу в микрофуговой пробирке.

Пипетируйте клеточную гранулу несколько раз для получения однородной суспензии. Чтобы лизировать клетки, инкубируйте пробирки при температуре 80 градусов Цельсия в течение 10-15 минут. Затем оставьте клетки на льду.

Повторите процесс центрифугирования при 16 000 г в течение пяти минут в настольной центрифуге при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования переложите надосадочную жидкость, содержащую лизат, в стерильную микрофужную пробирку объемом 1,7 миллилитра на лед и изгоните гранулу. К надосадочной жидкости добавьте пять моляров хлорида натрия для достижения конечной концентрации в один моляр.

Во-первых, подготовьте выдвижной буфер для стирки. После ночной инкубации после блокировки шариков перенесите трубку с магнитными шариками на магнит на две минуты. Выбросьте надосадочную жидкость после инкубационного периода.

К бусинам добавьте 150 микролитров ледяного выдвижного буфера для стирки. Затем закрутите бусины при комнатной температуре в течение 15 секунд. И сразу же инкубировать при комнатной температуре от 30 до 60 секунд.

Через минуту перенесите трубку с магнитными шариками на магнит на две минуты. Выбросьте надосадочную жидкость после инкубационного периода. Затем снова суспендируйте шарики в 300 микролитрах полного выдвижного буфера для стирки.

После добавления хлорида натрия переложите 300 микролитров клеточного лизата в микропробирку, наполненную 300 микролитрами гранул. Затем оставьте смесь на смесителе для накидки на час при комнатной температуре. Через час перенесите трубку на магнит на пять минут.

Выбросьте надосадочную жидкость после инкубационного периода. Затем добавьте 300 микролитров ледяного полного выдвижного буфера для стирки в бусины. После добавления буфера перемешайте бусины в течение 15 секунд при комнатной температуре.

Затем поместите трубку на магнит на пять минут. Выбросьте надосадочную жидкость после инкубационного периода. Затем растворите шарики в 100 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз, и храните на льду.

Выделите общую РНК из бусин. Затем растворите выделенную РНК в 25 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз. Далее измерьте концентрацию РНК в спектрофотометре.

Наконец, приготовьте раствор рабочего запаса РНК в концентрации 50 нанограмм на микролитр. Затем используйте 50 нанограммов общей изолированной РНК для синтеза комплементарной ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Затем добавьте олигогрунтовки до конечного объема 20 микролитров.

Поместите пробирку для ПЦР на амплификатор и начните прогон. После завершения количественной ПЦР перенесите девять микролитров реакционной смеси ПЦР в каждую лунку планшета. В каждую лунку добавьте по одному микролитру комплиментарной ДНК, чтобы получить конечный объем в 10 микролитров.

Затем используйте термостойкий запайщик для ПЦР-планшетов, чтобы запечатать ПЦР-планшет и загрузить его на термоциклер. Затем запустите программу на термоамплификаторе. Для валидации мишеней miR-125b изучаются уровни экспрессии мишеней мРНК PARP-1 и p53.

Интересно, что уровни экспрессии мРНК PARP-1 и p53 сравнительно выше, чем у мРНК Actin, которая является отрицательным контролем. Другие отрицательные контрольные группы, использованные в эксперименте, не являются шаблонами, а представляют собой три основные биотинилированные скремблированные последовательности. Кроме того, три простые нетранслируемые области PARP-1 и p53 количественно также демонстрируют различные уровни амплификации.

Это по сравнению с отрицательными контрольными группами, такими как актин, отсутствие матрицы и три основные биотинилированные скремблированные последовательности. Эта амплификация PARP-1 и p53 указывает на то, что они являются сильными мишенями для клеточного miR-125b. После освоения этой техники, начиная с нанесения покрытий на клетки, до трансфекции мимики LNA, меченной биотином, и заканчивая ПЦР-анализом, можно провести в течение недели, если все выполнено правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проверить предполагаемые мишени мРНК в клетках млекопитающих. Это может быть достигнуто с высоким соотношением специфичности к низкому уровню шума путем введения в клетки млекопитающих трех основных меченых биотином заблокированных нуклеиновых кислот, имитирующих их. Не забывайте, что работа с РНК, особенно с малыми РНК, такими как микроРНК, может быть очень чувствительной и склонной к деградации.

Таким образом, при проведении этого анализа следует принимать необходимые меры предосторожности, такие как использование воды, не содержащей нуклеаз, микропробирок без нуклеаз и стерильных буферов, а также следует учитывать свежеприготовленные буферы и реагенты при выполнении этого анализа для получения лучшей чувствительности и лучших результатов.