TreadWheel: Интервал подготовки протокола для нежно индуцированной упражнения в Drosophila melanogaster

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метаболических исследований, такие как определение того, могут ли конкретные вмешательства в образ жизни, такие как физические упражнения, принести пользу конкретным людям. Часто индивидуумы, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности с идентификацией личинок на первой стадии развития. Главное — собрать личинок почти того же размера, что и яйца.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что его можно использовать для оценки влияния физических упражнений на многие экспериментальные условия и генотипы. Во-первых, соберите камеры укладки для каждой опытной группы. Нанесите ложку дрожжевой пасты на тарелку с агаром для яблочного сока и закрепите тарелку на пластиковой бутылке объемом шесть унций.

Пластины для агара из яблочного сока изготавливаются путем приготовления раствора 3%-го агара в магазинном яблочном соке. А затем заполнение посуды 35 на 10 миллиметров на 3/4 вверх по стене. Дрожжевая паста изготавливается путем смешивания купленных в магазине активных сухих дрожжей с водой в соотношении около двух миллилитров дистиллированной воды на грамм дрожжей.

Держите пасту неплотно закрытой, чтобы обеспечить дегазацию, и нанесите около трех миллиметровых ложек на каждую пластину. Бутылка, изготовленная из полипропилена, должна быть подготовлена с небольшими отверстиями для вентиляции. После подготовки компонентов для камеры, приступайте к загрузке у взрослых особей.

Как только взрослые особи нужного генотипа окажутся в бутылке, закройте бутылку пластиной и закрепите сборку резинками. Обеспечение достаточного количества взрослых мух для камер для кладки, вероятно, требует начала наращивания численности популяции за несколько поколений до запланированного эксперимента. Теперь меняйте пластины с яблочным соком агара два раза в день, один раз утром и один вечером.

Затем дайте яйцам развиться на собранных пластинах в течение 12-24 часов в личинки первого возраста. Чтобы собрать этих личинок, используйте тонкую кисть или кирку, сделанную из гибкой тонкой иглы и ручки. Для каждой экспериментальной группы перенесите 50 личинок первого возраста в флакон со свежим кормом и дайте им развиться до взрослого возраста.

Чтобы убедиться, что вы в состоянии собрать достаточное количество личинок для каждой из ваших реплик, убедитесь, что есть исследователи, которые эффективно собирают личинки, чтобы получить нужное вам количество. После окукливания соберите куколок, предварительно намочив их с помощью небольшой влажной кисти. Затем аккуратно зачерпните куколки с боковых сторон флаконов с помощью шпателя.

Загрузите куколок в пустые флаконы. Затем, после выведения, переложите взрослых особей в стандартные флаконы с едой. Через один-пять дней после эклозии разделите мух по признаку пола и разделите каждый пол на две группы: экспериментальную и контролируемую.

Содержание взрослых особей составляет 50 мух во флаконе. Давайте мухам свежие флаконы с живыми дрожжами раз в два дня. Несмотря на то, что взрослых особей можно поддерживать без живых дрожжевых добавок, мы обнаружили, что взрослые особи лучше справляются с этой добавкой.

Добавки с живыми дрожжами — это переменная, которую исследователи могут изменить в соответствии со своими конкретными исследовательскими целями. В тренажере используется простая система ремней и шкивов, приводимая в действие двигателем с регулируемой скоростью. Перед использованием тренажера извлеките все прикрепленные к нему флаконы и откалибруйте скорость его двигателя с помощью источника питания таким образом, чтобы полный период вращения составлял 15 секунд.

Чтобы рассчитать скорость вращения, прикрепите маленькую кисть к крышке двигателя и расположите щетку так, чтобы она касалась одного из вращающихся кронштейнов. Затем замерьте количество сделанных оборотов, подсчитав контакты щетки и кронштейна в минуту. Используя откалиброванный тренажер, приступайте к первому дню упражнений, обычно в понедельник.

Вставьте в флаконы пробки флаконов. Оставьте мухам один сантиметр пространства в контрольных флаконах и шесть сантиметров пространства в флаконах для упражнений. Теперь поместите флаконы в зажимы и с 10 минут дайте мухам акклиматизироваться.

Тренажер вмещает до 48 флаконов. Комнатная температура должна оставаться постоянной на протяжении всей многодневной процедуры или же тренажер при желании может поместиться в инкубатор. Экспериментальный план состоит из пяти последовательных дней упражнений в неделю.

Каждый день упражнений содержит чередующиеся периоды упражнений и отдыха. Каждый день к одному из периодов упражнений добавляется пять минут, так что в течение пятидневной рабочей недели все четыре периода упражнений увеличатся на пять минут. Как только мухи акклиматизируются, начните первый период упражнений.

Запустите машину на 15 минут. Во время пятиминутного межпериодического отдыха оставьте флаконы на зажимах. После завершения четвертого цикла упражнений верните пробки флаконов с едой в их нормальное положение и верните мух в инкубатор.

Чтобы установить, влияют ли физические упражнения на TreadWheel на метаболические характеристики, было измерено накопление триглицеридов в Oregon R и желтой белой мухе, которые нормализовали концентрацию белка у мух. Статистический анализ выявил значительный генотип по взаимодействию физических упражнений, влияющий на накопление триглицеридов. Также наблюдался значительный эффект полового диморфизма, когда самцы накапливали больше триглицеридов, чем самки.

Самки тренированных мух имели значительно более низкий уровень триглицеридов, чем их нетренированные собратья. У самцов такого не наблюдалось. Затем мух выращивали на переменной диете, подвергали режиму физических упражнений, а затем проверяли на отрицательном геотаксис-анализе по типу RING.

Самки поднимались значительно выше при выращивании на диете с высоким содержанием жиров, чем при любом другом лечении. Для самцов физические упражнения улучшали скалолазание только тогда, когда они воспитывались на обычной диете. Диета с высоким содержанием жиров не оказала никакого эффекта.

Интересно, что наблюдалось снижение производительности скалолазания после упражнений у самок из линии DGRP 153 при выращивании на обычной диете. Таким образом, физические упражнения не могут быть одинаково положительным вмешательством для всех генотипов. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ уровня глюкозы в гемолимфе или анализ продолжительности жизни, чтобы оценить влияние физических упражнений на диабет II типа или продолжительность жизни.

Этот метод позволяет исследователям в области генетики и метаболизма изучить роль физических упражнений в поддержании метаболического здоровья в модельном организме дрозофилы.