Мембрана Ремоделирование гигантских пузырьков в ответ на локализованных кальций иона градиенты

Мы представляем технику манипуляций с гигантскими везикулами с использованием локализованных градиентов ионов кальция. Основным преимуществом данной методики является полностью бесконтактная стимуляция поверхности везикулы и прямая визуализация ремоделирования липидной мембраны при взаимодействии с ионами кальция. Наш подход представляет собой средство для рассмотрения деталей взаимодействий мембран ионов кальция, предоставляя новые возможности для изучения механизмов изменения формы клеточной мембраны при изменениях в микроокружении клетки.

Для начала этой процедуры приготовьте раствор липидов в хлороформе. Конечная концентрация липидов в хлороформе составляет один миллиграмм на миллилитр, а конечная масса – 0,6 миллиграмма. Оберните стеклянный флакон с липидной смесью металлической фольгой, чтобы защитить содержимое от окружающего света.

Поместите флакон с образцом, завернутый в металлическую фольгу, внутрь стеклянного стакана. Чтобы удалить хлороформ, растворитель выпаривают в ротационном испарителе в течение трех часов с давлением, достигающим вакуума в семь килопаскалей, при 80 об/мин. На дне стеклянного флакона после испарения образуется сухая липидная пленка.

Медленно добавьте 600 микролитров фосфатно-солевого буферного раствора поверх высушенной липидной пленки. После добавления буфера аккуратно добавьте шесть микролитров глицерина, чтобы защитить образец от полного обезвоживания во время образования гигантского униламеллярного везикулы, соединенного с многослойным везикулой, или GUV-MLV. Запечатайте стеклянный флакон с помощью парапленки.

И накрыть металлической фольгой для защиты от постороннего света. Храните флакон при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день проведите ультразвуковую обработку стеклянного флакона, содержащего раствор, в течение одной минуты с помощью ультразвуковой ванны комнатной температуры.

Снимите парапленку, и пижьте пипеткой до образования визуально однородного раствора из мелких липидных пузырьков. Аликвотировать 30 микролитров полученного мелкого раствора липидных пузырьков в отдельные пластиковые пробирки объемом 0,5 миллилитров. Разморозьте пластиковую трубку, содержащую аликвоту замороженной суспензии мелких липидных пузырьков, при комнатной температуре.

Переведите трубку четыре раза в течение одной-двух секунд с помощью вихревого миксера на максимальной скорости. Нанесите пять микролитров небольшой липидной суспензии на поверхность стеклянной крышки, чтобы образовалась маленькая круглая капля. Используйте стеклянный покровный лист без каких-либо действий по предварительной очистке.

Теперь поместите стеклянную покровную крышку в вакуумный эксикатор на 20 минут. Храните высохшую липидную пленку при комнатной температуре в течение четырех минут. Затем медленно пипетируйте 50 микролитров 10 миллимолярного буфера HEPES поверх сухой липидной пленки для регидратации.

Подождите пять минут, чтобы сформировать комплексы GUV-MLV. Расположите стеклянную защитную крышку по центру предметного столика микроскопа. Затем нанесите на него пипетку объемом 300 микролитров буфера HEPES и расположите центр капли над мишенью.

Перелейте 50 микролитров предварительно сформированного раствора GUV-MLV в раствор HEPES. Подождите 25 минут, чтобы разреженные комплексы GUV-MLV прочно прилипли к поверхности стеклянного покровного стекла. Закруглите края капилляров из боросиликатного стекла, осторожно поместив концы капилляров в пламя свечи, чтобы предотвратить поломку микропипетки при прикреплении ее к держателю микропипетки.

Вытяните не менее трех стеклянных капилляров с помощью автоматического лазерного пуллера. С помощью капилляров из боросиликатного стекла, упомянутых в тексте, получите микропипетку с отверстием наконечника диаметром примерно 0,3 микрона. Чтобы избежать засорения наконечника пипетки, перед использованием отфильтруйте пятимиллимолярный раствор хлорида кальция в буферном растворе HEPES с помощью шприцевого фильтра размером от 0,2 до 0,5 микрона.

Затем заполните каждую микропипетку восемью микролитрами раствора хлорида кальция с помощью микрозагрузчика. Подключите держатель микропипетки к микроманипулятору. Плотно закрепите микропипетку в держателе микропипетки.

Затем подсоедините ТНВД и держатель капилляра с помощью подающей трубки. После запуска ТНВД отрегулируйте настройки ТНВД до давления впрыска 20 гектопаскаль. Также установите пятигектопаскальное компенсационное давление.

Переведите микроскоп в режим яркого поля. Настройте его на контраст дифференциальной интерференции. С помощью грубого микроманипулятора расположите микропипетку над каплей, содержащей комплексы GUV-MLV.

Расположите кончик микропипетки над объективом и опустите пипетку до капли с помощью грубого микроманипулятора. Установите микроскоп в режим флуоресценции. Расположите наконечник микропипетки на расстоянии трех микрон от поверхности мембраны во время введения раствора хлорида кальция из микропипетки, чтобы обеспечить образование MTP.

Чтобы переместить MTPS по поверхности GUV, медленно перемещайте наконечник пипетки вокруг поверхности GUV с помощью тонкого микроманипулятора. Поддерживайте примерно одинаковое расстояние между поверхностью GUV и наконечником микропипетки, продолжая вводить ионы кальция. Чтобы остановить микровпрыск, выключите ТНВД.

Здесь показано репрезентативное изображение флуоресцентного микроскопического комплекса GUV-MLV, иммобилизованного на поверхности стеклянного покровного стекла. На этих изображениях можно увидеть выступы мембранных трубчатых выступов, образующиеся при локализованном впрыске ионов кальция на поверхность GUV. Перемещение кончика микропипетки вокруг поверхности мембраны, как указано стрелкой, вызывает движение выступов мембранных трубок в направлении источника ионов кальция.

Подводя итоги, можно сказать, что предложена методика, позволяющая проводить бесконтактное мембранное ремоделирование гигантских липидных везикул, что приводило к образованию протрузий мембранных канальцев при локализованной стимуляции ионами кальция. Будущие применения этого метода включают переход от синтетических липидных везикул к нативным биологическим мембранам или применение этого подхода к полимерным системам с целью разработки бесконтактных платформ для микроманипуляций.