Гибкие низкая стоимость гидропоники системы для оценки реакция растений на небольших молекул в стерильных условиях

Простая, универсальная и недорогая гидропонная система in vitro была успешно оптимизирована, что позволило проводить крупномасштабные эксперименты в стерильных условиях. Эта система облегчает нанесение химических веществ в растворе и их эффективное поглощение корнями для молекулярных, биохимических и физиологических исследований. Мы продемонстрировали, что эта система обладает высокой эффективностью при получении однородных сеянцев на начальном этапе развития, а также при разделении корней и побегов с использованием семян арабидопсиса талиана.

Для построения гидропонной системы и выращивания растений в стерильных, контролируемых условиях необходимы следующие элементы: 7% этанол, 10% раствор отбеливателя, полисорбат 20, среда MS, включая витамины. MES моногидрат, агар, гидроксид калия.

Ламинарный колпак, конфорка, ростовая камера. Одноразовые пластиковые коробки, стерильные стеклянные чашки Петри, клейкая лента, стерильные наконечники для пипеток на 200 и 300 микролитров, ножницы, многоканальная пипетка на 300 микролитров, пипетка на 200 микролитров, лезвие скальпеля, пинцет, а также штативы для наконечников пипеток на 200 микролитров. Очень важно, чтобы плоский кончик пипетки имел область, которая должна быть заполнена твердой средой.

Простерилизуйте наконечники пипеток штативом без крышек, которые будут использоваться в качестве мини-емкостей в автоклаве при температуре 121 градус в течение 20 минут. Во избежание загрязнения все ранее упомянутые материалы были стерилизованы в автоклаве. Когда это было невозможно, как в случае с одноразовыми пластиковыми коробками, материалы очищали 7% этанолом перед подачей в колпак с ламинарным потоком.

Если вытяжка позволяет, ультрафиолетовый свет можно включить за 10 минут до сборки гидропонной системы. Заклейте верхнюю поверхность наконечника пипетки клейкой лентой. Если есть возможность, оставьте их под ультрафиолетовым светом на 10 минут.

Затем добавьте по 108 микролитров расплавленной твердой среды в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Если вы готовите много резервуаров, используйте горячую плиту, чтобы предотвратить затвердевание среды MS. Дайте среде полностью застыть, около 30 минут.

В период застывания можно включить ультрафиолетовое излучение. Полностью заполните коробку для наконечников жидкой питательной средой. Гарантия компактного взаимодействия между твердыми и жидкими средами.

Снимите клейкую ленту с верхней поверхности наконечника пипетки и аккуратно прикрепите его к штативу. Гидропонная система теперь готова к приему стерилизованных семян. Описанная здесь стерилизация жидким отбеливателем является практичным методом стерилизации семян.

Сначала поместите 500 семян арабидопсиса в микропробирку объемом 1,5 мл. Используйте столько микропробирок, сколько необходимо в соответствии с количеством растений, необходимых для эксперимента. Промойте семена с 7%-ным этанолом в течение двух минут при перемешивании.

Осторожно удалите этанол. Добавьте один мл 10%-ного раствора отбеливателя, содержащего два микролитра полисорбата 20 моющего средства. Помешивайте в течение пяти минут.

Аккуратно удалите раствор. Наконец, промойте семена стерилизованной дистиллированной водой до полного удаления всех остатков отбеливателя, примерно пять раз. Этот протокол осуществим для арабидопсиса, однако эта система может быть использована и для других видов растений.

С этой целью указанная процедура стерилизации должна быть модифицирована в соответствии с требованиями к виду. После поверхностной стерилизации семена погружали в стерильную дистиллированную воду и стратифицировали при четырех градусах в темноте в течение пяти дней для синхронизации прорастания. Слегка разрежьте конец 200 микролитров наконечника пипетки с помощью стерильного скальпеля.

Пипетируйте семена арабидопсиса в твердую питательную среду на верхней поверхности кончика пипетки плоско. Следите за тем, чтобы среда не рыхлилась с плоской, иначе семена будут в тени и рассада не будет расти должным образом. Храните как можно больше мини-баков внутри одноразового пластикового ящика, чтобы поддерживать высокую влажность и окружающую среду, свободную от микроорганизмов.

Заклейте одноразовую пластиковую коробку с помощью скотча. Гидропонные системы теперь готовы к входу в камеру выращивания. Эта гидропонная система была первоначально разработана для облегчения введения химических веществ в растения, таких как изотопные меченые соединения, которые, как правило, очень дороги для применения в крупномасштабных экспериментах.

В качестве доказательства концепции мы использовали конкурентный ингибитор АТФ AZD8055, который специфически нацелен на сайт связывания АТФ целевой рапамициновой протеинкиназы. TOR-киназа является основным регулятором, объединяющим восприятие питательных веществ и передачу энергетических сигналов для стимулирования пролиферации и роста клеток. Для оценки первичных реакций на ингибирование TOR, опосредованное AZD, семена арабидопсиса выращивали гидропонным способом до желаемой стадии развития в течение 12-часового фотопериода.

Свежая среда, содержащая два микромолярных AZD или 0,05% ДМСО в качестве контроля, была заменена в гидропонных резервуарах в конце ночи. Рассаду собирали в разные моменты времени после обработки, разделяли на замороженные в жидком азоте корни и побеги, измельчали в мелкий порошок и хранили при температуре минус 80 градусов до использования. Паттерн фосфорилирования рибосомального белка S6-киназы, RPS6, одной из хорошо известных мишеней пути TOR.

Иммуноблоттинг показывает количество общего и фосфорилированного RPS6 в корнях, график А, и побегах, график В. Подавление фосфорилирования в присутствии ADZ855 происходило уже через 30 минут после лечения препаратом как в корнях, так и в побегах, демонстрируя, что в использованных экспериментальных условиях ADZ также показал себя мощным ингибитором TOR, который быстро подавляет его киназную активность. Трансгенные линии арабидопсиса с пониженной экспрессией гена TOR или компонентов комплекса TOR демонстрируют явный фенотип избытка крахмала. Качественный анализ крахмала с использованием раствора Люголя позволяет выявить ожидаемую закономерность накопления и деградации крахмала в течение цикла.

У рассады, которая не получала MSO или AZD855, не наблюдалось большего накопления крахмала в листьях в конце ночи, а накопление крахмала в контрольных растениях, MSO, соответствовало литературным данным. Кроме того, растения, обработанные AZD, имели большее количество остаточного крахмала в конце ночи по сравнению с контрольной рассадой. Эти результаты указывают на полезность предложенной гидропонной системы при выращивании рассады, имитирующей физиологические условия.

Крахмал накапливается в листьях в течение дня и ремобилизуется в течение ночи для поддержания метаболической активности. В нормальных условиях в конце ночи остается лишь небольшая доля крахмала, от 5 до 10% от общего количества после окончания дня. Эти результаты проверены, что фенотип крахмала, наблюдаемый при подавлении TOR, происходит на протяжении всего цикла.

Растения, выращенные на гидропонике, сравнивали с рассадой, выращивающей садовый субстрат в очень похожих климатических условиях в отношении уровня экспрессии абсцизовой кислоты с чувствительным фактором связывания третьего элемента, гена ABF3, показанного на рисунке 5-А. Экспрессия ABF3 напрямую коррелирует с внутренними уровнями ABA, класса гормонов, широко известных как маркеры из-за его роли в множественных абиотических стрессовых реакциях. Несмотря на то, что растения, выращенные на гидропонике, продемонстрировали значительное увеличение экспрессии ABF3 по сравнению с растениями, выращенными в почве, уровни экспрессии аспарагинсинтетазы ASN1 не были затронуты обработками MSO или AZD, показанными на рисунке 5-B.

Тем не менее, экспрессия трегалозефосфатсинтазы 5, TPS5, плюс значительное увеличение после восьми часов подавления TOR. ASN1 и TPS5 реагируют на низкий и высокий уровни сахара соответственно, что позволяет предположить, что эти растения не испытывали генетического стресса. Мы успешно использовали эту систему для оценки применения малых молекул в растениях.

Подводя итог, можно сказать, что эта гидропонная система обладает многими преимуществами, потому что она очень быстрая и простая в сборке, а также имеет низкую стоимость, так как основные компоненты дешевы и могут быть широко использованы повторно. Кроме того, эта система универсальна, позволяя изучать неповрежденные саженцы или различия в развитии растений, и она обладает высокой масштабируемостью, что позволяет выращивать огромное количество растений на очень небольшой площади.