Экран 2-гибрид дрожжи в пакете для сравнения взаимодействий протеина

Этот метод использует принцип двухгибридной системы дрожжей в обеих популяциях для выявления белок-белковых взаимодействий, которые отвечают на ключевые вопросы о различных молекулярных и клеточных процессах. Этот метод использует глубокое секвенирование, чтобы увидеть взаимодействие одного белка с другим. Поскольку этот подход ориентирован на проведение параллельных сравнений, он может идентифицировать наборы белков, которые взаимодействуют с одним белком по сравнению с другим или различными подтверждениями одного и того же белка, или при типировании мутантной версии, вызывающей заболевание, выявить дифференциальные интерактомы.

Для этой процедуры была сконструирована новая двухгибридная дрожжевая плазмида pTEF-GBD, как описано в текстовом протоколе. Эта плазмида продуцирует белки слияния ДНК-связывающих доменов Gal4 в плазмиде на основе центромеры TRP1 с низкой копией, несущей ген устойчивости к канамицину, который также позволяет клонировать фрагменты приманки как вверх, так и ниже по потоку ДНК-связывающего домена Gal4. Эта приманочная плазмида была использована для трансформации дрожжей MATa, а экспрессия белков слияния приманки Gal4 была проверена с помощью иммуноблоттинга анти-MIC антителами.