Информатики анализ последовательности данных из пакетного дрожжи 2-гибрид экраны
28 июня 2018 г.
Глубокая последовательности дрожжей населения, отобранных для положительных дрожжи 2-гибрид взаимодействия потенциально дает огромное количество информации о взаимодействующих партнер белков. Здесь мы описываем функционирования конкретных Биоинформатика инструменты и заказной обновленное программное обеспечение для анализа данных последовательности от таких экранов.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о природе белковых взаимодействий. Основное преимущество этой методики заключается в том, что вся биоинформатическая обработка управляется простым в использовании интерфейсом. Это программное обеспечение использует удобный графический пользовательский интерфейс, который молекулярные биологи, клеточные биологи и биохимики, не имеющие большого опыта в биоинформатике, могут использовать для легкого завершения своего анализа.
Как правило, люди, не знакомые с обработкой данных о последовательностях, испытывают трудности из-за того, что компьютерные программы запутаны и громоздки. Мы думали, что упрощение информатики сделает всю технику гораздо более доступной и полезной. Первым шагом в этой процедуре является загрузка и установка программного обеспечения MAPster, как описано в текстовом протоколе.
Далее введите необходимые файлы и параметры через вкладку Основные. Выберите соответствующую кнопку Попарно, чтобы ввести файлы для анализа DEEPN. Установите опцию Попарно в положение Выкл., чтобы работать в формате одиночного чтения.
Загрузите файлы в MAPster путем перетаскивания в соответствующее окно. Из индексированных геномов, перечисленных в поле «Геном», выберите эталонный источник генома ДНК, соответствующий источнику вставок библиотеки добычи Y2H. Поскольку HISAT2 поддерживает многопоточность, в поле «Потоки» укажите количество компьютерных процессов, которые должны быть выделены программе отображения.
Укажите имя выходного файла, рекомендуется использовать короткое, но описательное имя без пробелов и специальных символов, поскольку это имя файла будет использоваться на протяжении всего процесса DEEPN. С помощью кнопки «Открыть каталог вывода» укажите папку для вывода сопоставленных файлов. После выбора соответствующих файлов и параметров используйте кнопку «Добавить в очередь», чтобы добавить задание сопоставления в очередь заданий.
После того, как все задания будут введены в очередь заданий, нажмите кнопку «Запустить очередь». Начните этот анализ, открыв программное обеспечение DEEPN. В главном окне выберите соответствующую информацию о библиотеке добычи в верхнем поле выбора.
Выберите папку, в которую могут поместиться обработанные файлы, нажав кнопку «Рабочая папка» и перейдя в директорию папки. После выбора рабочей папки DEEPN создаст три подпапки с указанными именами. Для успешного анализа убедитесь, что вы поместили правильные файлы SAM в правильные папки и знаете, какие файлы были сопоставлены и не сопоставлены.
Если вы используете файлы sam, содержащие как отображенные, так и неотображенные чтения, например, созданные с настройками программы MAPster по умолчанию, поместите их в папку sam_files. Начните обработку, нажав кнопку Gene Count plus Junction Make. Время обработки зависит от размера и количества файлов данных последовательности и скорости обработки используемого компьютера.
После того, как DEEPN обработает данные, будет создан полный набор папок. Следующим шагом будет выполнение анализа в Stat Maker. Откройте Stat_Maker и нажмите кнопку «Подтвердить установку».
Если вы работаете впервые, Stat_Maker автоматически установите R, JAGS и Bioconductor, извлекая эти ресурсы из Интернета. Как только R, JAGS и Bioconductor будут обнаружены, Stat_Maker станут активными и позволят пользователю вводить дополнительные данные. Нажмите кнопку «Выбрать папку», чтобы перейти к рабочей папке, которую обработал DEEPN.
Stat_Maker автоматически найдет и перечислит файлы для статистического анализа в окне. Перетащите соответствующие файлы из окна списка файлов выше в окна файлов ниже для каждого вектора и набора данных приманки, а также для всех невыбранных и выбранных условий роста. Важно отметить, что для Stat_Maker требуются дубликаты наборов данных только для пустого вектора, двух выборок неотобранных популяций и двух выборок выбранных.
Это дает оценку вариабельности в рамках эксперимента. Нажмите кнопку «Выполнить». В зависимости от скорости работы компьютера вычисления займут от пяти до 15 минут.
Результаты Stat_Maker выходных данных помещаются в новую вложенную папку в основной рабочей папке под названием Stat_Maker Результаты». Просмотрите результаты. Чтобы просмотреть данные о каждом потенциальном кандидате, откройте программное обеспечение DEEPN, выберите соответствующую информацию о библиотеке добычи, а затем выберите правильную рабочую папку, используя рабочую папку.
Нажмите кнопку Blast Query, чтобы загрузить новое окно. В верхнем текстовом поле введите имя гена или номер GenBank NM, чтобы выбрать интересующий вас ген-кандидат. Имя гена соответствует имени, указанному в выходном файле Stat Maker.
Тип Enter или Return, который инициирует извлечение интересующего гена. Выберите, какие наборы данных будут использоваться для анализа, с помощью меню Выбрать набор данных. Как правило, к ним относятся только вектор и образцы приманки, выращенные в неселективных условиях, и образцы приманки, выращенные в условиях селекции.
Первоначально загрузка данных и названия гена может занять некоторое время с помощью программы Blast Query, но как только набор данных будет загружен, все будет происходить гораздо быстрее. Blast_Query отобразит точки слияния в интересующей вас последовательности и количество каждой точки слияния. Это может быть отображено как в табличном формате с помощью вкладки Результаты, так и в графическом формате с помощью вкладки График.
Чтобы экспортировать эти результаты в файл csv, нажмите кнопку «Сохранить CSV» в правом верхнем углу. В окне DEEPN нажмите кнопку «Глубина чтения» в разделе «Анализ данных». Как только окно «Глубина чтения» будет открыто, введите номер NM в верхнее текстовое поле.
Используйте раскрывающееся меню, чтобы выбрать соответствующий набор данных, содержащий интересующий обогащенный ген. Используйте таблицу слева и графический дисплей справа, чтобы определить, сколько прочтений было обнаружено в данных, соответствующих интересующему гену. Программа Stat Maker создает файл для просмотра в формате Excel, в котором обобщена соответствующая информация, необходимая для идентификации потенциальных взаимодействующих белков.
Также показан соответствующий анализ того, содержат ли плазмиды, соответствующие кандидату в жертвы, надлежащую открытую рамку считывания. Blast Query оценивает каждый ген и упорядочивает различные позиции в соответствии с их распространенностью в наборе данных, количественно выраженным в ppm от общего числа соединений, найденных в базе данных. В данном примере наиболее распространенной позицией, которая находится в ORF и в кадре, является позиция 867, указывающая на то, что нуклеотид 867 референсной последовательности GenBank NCBI NM_019648 является началом фрагмента добычи.
На этом рисунке показана гипотетическая последовательность и способы создания олиго с пятью простыми числами, чтобы захватить правильную систему кадров и точку слияния между доменом активации Gal4 и интересующей последовательностью жертвы. Это окно глубины чтения показывает, сколько последовательностей было найдено в данных, которые соответствуют нуклеотидным положениям интересующей последовательности. После освоения обработка данных может быть выполнена за 10-20 часов, большую часть времени без присмотра.
Экраны DEEPN и соответствующий анализ информатики проложат путь исследователям в широком спектре областей к исследованию сетей взаимодействия с интересующим их белком. Программа MAPster предназначена для упрощения отображения файлов последовательностей из экспериментов DEEPN. Он также предоставляет удобный для пользователя метод сопоставления файлов последовательностей со ссылками на ДНК для различных приложений, таких как RNA-Seq или ChIP-Seq.
Несмотря на то, что программное обеспечение DEEPN специально создано для обработки двухгибридных данных партийных дрожжей, его также можно использовать для обработки данных RNA-Seq. Программа Stat Maker не только предсказывает, какие гены обеспечивают подлинное двухгибридное взаимодействие дрожжей, но и сопоставляет ряд других параметров, таких как считывание кадровой информации, что позволяет исследователям быстро фильтровать свои потенциальные попадания. После того, как кандидаты на взаимодействие белков идентифицированы, важно проверить взаимодействия с помощью стандартных двухгибридных анализов дрожжей, биохимических анализов или родственных методов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье рассматривается метод анализа протеиновых интерактомов с помощью глубокого секвенирования популяций дрожжей, отобранных по положительному взаимодействию в системе дрожжевой двугибридной селекции. Особое внимание уделяется использованию удобных биоинформатических инструментов, которые упрощают процесс анализа для исследователей, не обладающих глубокими знаниями в области биоинформатики.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биоинформатика
- Белок-белковые взаимодействия
- Биология дрожжей
Теоретическая база
- Интерактомы белков представляют собой сложные сети белок-белковых взаимодействий.
- Традиционные инструменты биоинформатики могут быть сложны в использовании для специалистов из других областей.
- Повышение доступности биоинформатики может улучшить результаты исследований.
- Программное обеспечение MAPster разработано для оптимизации процесса анализа.
Цель исследования
- Предоставить метод анализа белок-белковых взаимодействий у дрожжей.
- Разработать удобное программное обеспечение для биоинформатической обработки данных.
- Сделать анализ белковых взаимодействий доступным для более широкого круга исследователей.
Используемые методы
- Глубокое секвенирование популяций дрожжей.
- Использование программного обеспечения MAPster для анализа данных.
- Внедрение графического интерфейса пользователя для удобства эксплуатации.
- Пошаговый протокол установки и работы с программным обеспечением.
Основные результаты
- Программное обеспечение упрощает анализ белковых взаимодействий.
- Исследователи могут легко ориентироваться в интерфейсе без длительного обучения.
- Повышенная доступность способствует более эффективным результатам исследований.
- Потенциал для более широкого применения в молекулярной биологии.
Выводы
- Удобные в использовании биоинформатические инструменты могут сделать исследования более доступными.
- Программное обеспечение MAPster является ценным ресурсом для анализа интерактомов белков.
- Обеспечение доступности биоинформатики может стимулировать инновации в биологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет осуществлять высокопроизводительную идентификацию белок-белковых взаимодействий с помощью дрожжевого двухгибридного скрининга в сочетании с глубоким секвенированием, предоставляя количественные данные об обогащении, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков на ранних этапах поиска. Интегрированный биоинформатический рабочий процесс снижает зависимость от специализированных знаний, ускоряя переход от хитов к лидам за счет получения воспроизводимых карт взаимодействий с разрешением по кадрам считывания. Такой подход повышает прогностическую уверенность при выборе мишеней и поддерживает проведение масштабируемых кампаний скрининга в различных терапевтических областях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем картирования транзиторных и статических белковых взаимодействий в нативных клеточных контекстах.
- Практическая ценность: обеспечивает количественные профили обогащения, которые позволяют отличить специфические интеракторы от фонового шума, что повышает достоверность определения мишеней.
- Прогностическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней и уточнению путей передачи сигнала, помогая в доклинической сортировке и принятии решений с учетом рисков.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает детальное разрешение субдоменов взаимодействующих белков, что позволяет проводить картирование эпитопов и характеризацию интерфейса связывания.
- Операционная ценность: стандартизирует скрининг библиотек «добычи» (prey library) за счет автоматизированного картирования и подсчета прочтений, что гарантирует воспроизводимость между различными партиями.
- Ценность масштабируемости: облегчает подготовку валидированных наборов данных о взаимодействиях для последующего скрининга, позволяя повторно использовать их при подтверждении хитов и оптимизации соединений-лидеров.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации путем предоставления плазмидных последовательностей с исправленным сдвигом рамки считывания для последующего функционального анализа.
- Механистическое снижение рисков: позволяет фильтровать кандидатов с помощью анализа рамки считывания и открытой рамки считывания, сокращая количество ложноположительных результатов перед биохимической валидацией.
- Прогностическая достоверность: позволяет приоритизировать высокоэкспрессируемые точки слияния в правильной рамке считывания для проведения последующих анализов, таких как пул-даун или ко-иммунопреципитация.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум ранних этапов поиска, обеспечивая идентификацию мишеней посредством профилирования взаимодействий и способствуя поиску ведущих соединений на основе валидированных сетей взаимодействий.
- Открытия в биологии: Поддерживает проверку гипотез и выяснение путей взаимодействия путем идентификации обогащенных белков-мишеней в условиях селекции.
- Скрининг: Обеспечивает количественные данные о взаимодействиях, готовые для анализа, с дублированием образцов для оценки вариабельности, что повышает надежность скрининга.
- Аналитика: Обеспечивает статистический анализ обогащения и разрешение на уровне соединений, что позволяет сравнивать силу взаимодействия при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты с доклинической работой путем проверки целостности рамки считывания, гарантируя, что клонированные фрагменты экспрессируют полноразмерные функциональные домены.
- Корпоративное повторное использование: Создает стандартизированный модульный биоинформационный конвейер, применимый к RNA-Seq и ChIP-Seq, что увеличивает эффективность использования платформы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает уверенность в прогнозировании валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности благодаря картированию взаимодействий с разрешением по доменам.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию с помощью автоматизированного подсчета ридов, статистического моделирования и анализа кадров.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет возможности раннего снижения рисков для мишеней с помощью надежных сетей взаимодействий.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков, предоставляя количественные и воспроизводимые данные о взаимодействиях для ранжирования мишеней.
Особенности реализации
- Требуются знания принципов дрожжевой двухгибридной системы и проектирования библиотек плазмид.
- Необходима вычислительная инфраструктура для выравнивания последовательностей (HISAT2), статистической обработки (R/JAGS) и хранения файлов FASTQ/SAM.
- Требуются стандартизированные форматы входных данных и дублирующий отбор проб (пустой вектор, неселективные и селективные образцы) для получения достоверных статистических выводов.
- Необходима адаптация выбора референсного генома в зависимости от происхождения библиотеки «добычи» (prey library) для обеспечения точного картирования.
- Метод ограничен необходимостью ортогональной валидации (например, биохимическими анализами) для подтверждения предсказанных взаимодействий.
