Decellularization и Recellularization методика для человека подкожной вены

Этот метод подробно описывает процедуру тканевой инженерии подкожных вен. Также мы демонстрируем подготовку установок для децеллюляризации и биореактора для рецеллюляризации с использованием простых аппаратов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что для рецеллюляризации требуется простой образец крови, что исключает болезненное скопление костного мозга и трудоемкие процедуры культивирования клеток.

Для перфузии и промывки Triton-X 100 приготовьте установку для децеллюляризации. К двухлитровой камере прикрепите все три куска трубки А. Приклейте одну трубку скотчем к стене там, где край касается дна камеры для входа моющего средства. Прикрепите две другие трубки к противоположной стенке с расстоянием от пяти до 10 сантиметров между ними, в зависимости от длины жилы.

Не менее пяти сантиметров этих трубок также должны быть прикреплены скотчем к полу камеры. Подсоедините входную трубку моющего средства к трубке B с помощью соединителей для приманки с наружной и внутренней резьбой. Затем подсоедините трубку B к трубке F, а трубку F к трубке C. Подсоедините трубку C к входу в вену.

Теперь вставьте трубку F в кассету перистальтического насоса. Возьмите еще одну трубку С и подсоедините один конец к выходу вены. Поместите другой конец в стеклянную банку, оснащенную нижним выходным отверстием для шланга и расположенную на высоте 45 сантиметров над камерой, и закрепите ее скотчем.

Это служит выходом моющего средства. Затем вставьте один конец трубки G в отверстие для шланга стеклянной банки, а другой конец поместите в камеру для вен. Затем подготовьте вторую установку децеллюляризации для перфузии TnBP, как описано в текстовом протоколе.

Также подготовьте третью установку децеллюляризации для перфузии ДНК, как подробно описано в тексте, и поместите ее при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы подготовить биореактор для рецеллюляризации, вставьте трубку H в один из четырех портовых колпачков, который будет служить выходом вены. Во второй порт вставьте трубку I, которая будет служить входом для среды.

И в третье отверстие вставьте трубку J для входа в вену. Затем вставьте другой конец трубки H в четвертый порт, который будет служить выходом для носителя. Соедините переходные соединители с внутренними концами трубок H и J. Согните другой конец трубки J в форме буквы U и завяжите его швом.

Теперь поместите 60-миллилитровую трубку с плоским дном в стакан объемом 250 миллилитров. Затем подсоедините один конец трубки K к входу вены и подсоедините другой конец к трубке E. Подключите трубку E к второй трубке K, а затем к входу среды. Затем поместите подготовленный колпачок в тюбик, присутствующий в бутылке.

Наконец, стерилизуйте биореактор методом автоклавирования. Выполните два цикла замораживания-размораживания на подкожной вене человека, как подробно описано в текстовом протоколе, прежде чем разрезать ножницами биопсию длиной два миллиметра. Зафиксируйте биопсию в формальдегиде на срок от 24 до 48 часов при комнатной температуре.

Привяжите каждый конец вены к заусенцам соединителя приманки самца и самки швом. Подключите вену к установке децеллюляризации один и заполните камеру одним литром раствора два. Теперь перфузируйте в течение 15 минут со скоростью 35 миллилитров в минуту и опорожните содержимое установки.

Затем добавьте один литр раствора в четыре раза и перфузируйте в течение четырех часов по 35 миллилитров в минуту. Высыпаем содержимое, добавляем 500 миллилитров раствора два, выдерживаем в течение пяти минут, и снова высыпаем содержимое. Отсоедините вену от первой перфузионной установки и подключите ее ко второй перфузионной установке.

Далее добавьте один литр раствора пять, включите мешалку, и перфируйте в течение четырех часов по 35 миллилитров в минуту. Отсоедините вену от второго перфузионного набора и дважды промойте наружную часть вены 20 миллилитрами сверхчистой воды. Затем с помощью шприца дважды промыть внутреннюю часть вены 20 миллилитрами сверхчистой воды в течение 5-10 минут.

После перфузии с первой перфузионной установкой, как описано в текстовом протоколе, подключите вену к первой перфузионной установке. Залить один литр раствора двумя и перфузировать в течение ночи со скоростью 35 миллилитров в минуту. Повторите процесс перфузии четыре раза для полного удаления ядерного материала.

После перфузии опустошите установку, наполните один литр раствора двумя и перфузируйте в течение 24 часов со скоростью 35 миллилитров в минуту. Через 24 часа снова опорожните установку и залейте одним литром сверхчистой воды. Перфузируйте еще 24 часа по 35 миллилитров в минуту.

Наконец, повторите перфузию с использованием тех же условий, но с седьмым раствором. После проверки децеллюляризации, как описано в текстовом протоколе, простерилизуйте вену, поместив ее в 50 миллилитровую пробирку, содержащую 50 миллилитров раствора восьмилитров. Взбалтывайте со скоростью 80 оборотов в минуту в шейкере в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия.

Работая в ламинарном проточном шкафу для поддержания стерильности, теперь с помощью стерильных щипцов переносят стерильную вену в новую 50 миллилитровую пробирку, содержащую 50 миллилитров стерильного раствора семи, содержащую 500 микролитров анти. По-прежнему взбалтывайте вену в течение 12 часов, меняя раствор семь раз между ними, по крайней мере, дважды. С помощью стерильных щипцов перенесите вену в новую 50 миллилитровую трубку, добавьте 50 миллилитров эндотелиальной среды, и взбалтывайте в течение 11 часов.

Теперь соедините вену, привязав ее к входу и выходу вены биореактора стерильным швом и щипцами, и затяните колпачок на бутылке объемом 250 миллилитров. Заполните биореактор той же эндотелиальной средой. Добавьте гепарин по 50 единиц на миллилитр и перфузируйте в течение одного часа по два миллилитра в минуту в инкубаторе.

Соберите от 15 до 25 миллилитров свежей крови донора в вакутайнерные пробирки, покрытые гепарином, и разведите их один к одному раствором стина. Позже добавьте фактор роста эндотелия сосудов, полученный из эндокринных желез, основной фактор роста фибробласта и тонкую салициловую кислоту. После опорожнения эндотелиальной среды из биореактора добавьте в нее кровь и перфузируйте в течение 48 часов по два миллилитра в минуту в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с пятью процентами углекислого газа.

Примерно через 12 часов в ламинарном шкафу проводятся работы по удалению капли крови из биореактора и измерению уровня глюкозы с помощью устройства для мониторинга уровня глюкозы в крови. Если уровень составляет менее трех миллимоль на литр, добавьте глюкозу, чтобы привести его в диапазон от семи до девяти миллимоль на литр. Через 48 часов после возвращения в инкубатор слейте кровь из биореактора в ламинарном шкафу.

Добавьте 30 миллилитров стерильного раствора семь, профужьте в течение пяти минут, и слейте раствор. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока кроваво-красный цвет не потеряется. Наконец, добавьте от 30 до 45 миллилитров эндотелиальной среды и перфузируйте в течение 96 часов в инкубаторе со скоростью два миллилитра в минуту.

Отсоедините рецеллюляризованную вену от биореактора в ламинарном шкафу, отрежьте ножницами пять миллиметровых краев вены и выбросьте. Возьмите биопсию, как и раньше, поместите в формальдегид и проведите верификацию рецеллюляризации, как описано в текстовом протоколе. Грубая морфология нормальной жилки выглядит ярко-красным цветом.

Красный цвет теряется в прогрессирующих циклах децеллюляризации, а после пяти циклов лечения выглядит бледным и белым. Вена, рецеллюляризированная перфузией периферической крови и эндотелиальной среды, снова выглядела ярко-красной по цвету. Здесь показано репрезентативное изображение нормальной вены, окрашиваемое гемотоксилином и эозином, показывающее наличие многих синих ядер.

Тем не менее, синие ядра не были замечены при окрашивании децеллюляризованной вены гемотоксилином и эозином. В целлюляризированной вене, перфузированной кровью и эндотелиальной средой, окрашивание гемотоксилином и эозином показало наличие прикрепления клеток в просвете. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить децеллюляризацию подкожной вены детергентами и рецеллюляризацию периферической кровью и эндотелиальной средой.

Этот метод децеллюляризации с использованием перфузии Triton-X 100, TnBP и ДНК под давлением оказался успешным и воспроизводимым при удалении ядер из подкожных вен человека. Несмотря на то, что этот метод занимает 20 дней, хранение децеллюляризованной вены в качестве продукта быстрого хранения сократит время процедуры до восьми дней. Рецеллюляризация вен с использованием периферической крови реципиента может считаться клинически значимой.

Рецеллюляризация вен по аналогичному протоколу показала многообещающие результаты в клинической трансплантации, обеспечивая функциональное кровоснабжение после операции. С небольшими изменениями этот протокол может быть использован для любого типа вен, а также в качестве персонализированного трансплантата в клиниках для всех сосудистых операций.