Изоляция, расширение и адипогенном индукции CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток от человека сальниковый и подкожной жировой ткани

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ожирения, такие как выявление ключевых факторов и механизмов, которые предотвращают устойчивую адипогенную реакцию во время ремоделирования жировой ткани. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет выделить CD34+CD31+эндотелиальные клетки из жировой ткани человека, начиная с небольшого количества ткани. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы хотели идентифицировать клетки жировой сосудистой сети человека, которые реагируют на адипогенную стимуляцию.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы выделения клеток трудно практиковать из-за часто ограниченного доступа к свежей жировой ткани человека. Соберите материал из сальментной и подкожной жировой ткани человека у людей, перенесших бариатрическую операцию. Сразу после извлечения ткани следует хранить сальниковую и подкожную жировую клетчатку человека в отдельных флаконах, содержащих буферизованный раствор соли Хэнка с концентрацией 50 мкг на миллилитр стрептомицина пенициллина при комнатной температуре.

После того, как образец поступит в лабораторию после извлечения ткани, тщательно очистите и удалите фиброзные и прижженные участки ткани с помощью ножниц и пинцета, содержащих 70% этанола. Взвесьте жировую ткань и разделите ее на пять граммовых аликвот для усвоения коллагеназы. С помощью двух пар ножниц мелко измельчите пять граммов жировой ткани в пяти миллилитрах раствора коллагеназы в сцинтилляционном флаконе при комнатной температуре.

Добавьте в измельченную салфетку дополнительно 10 миллилитров раствора коллагеназы всего на 15 миллилитров. Переваривайте образцы в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане с непрерывным встряхиванием. После разложения вылейте образцы в шприц с тупым концом объемом 20 миллилитров.

Отфильтруйте образец через нейлоновую сетку толщиной 250 микрон в коническую трубку объемом 50 миллилитров, чтобы отделить адипоциты и стромальные сосудистые клетки от непереваренной ткани. Промойте сцинтилляционный флакон 10 миллилитрами KRBBS и пропустите промывку через фильтр для сбора остаточных клеток перед инкубацией отфильтрованных образцов в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем используйте шприц объемом 20 миллилитров и иглу для пипетирования размером 20 на шесть дюймов, чтобы удалить слой стромальной сосудистой фракции и перенести его в чистую коническую трубку объемом 50 миллилитров.

Добавьте 10 миллилитров KRBBS и дайте образцам постоять на скамейке в течение пяти минут при комнатной температуре. Храните стромальные сосудистые фракции из обоих депо на льду для дальнейшей обработки. Вращайте стромальные сосудистые фракции при 500 умноженных на G в течение пяти минут при температуре 4 градуса Цельсия.

Извлеките образцы из центрифуги и осторожно слейте надосадочную жидкость, сохранив гранулу, содержащую клетки стромальной васкулярной фракции. Аккуратно повторно суспендируйте клеточные гранулы в пяти миллилитрах PBS. После повторного вращения образцов удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре PBS и подсчитайте клетки.

Оболочьте образцы гранулами в третий раз и повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах изоляционного буфера CD34. Добавьте 10 микролитров коктейля CD34 и инкубируйте образец в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем добавьте пять микролитров магнитных шариков и выдержите образец в течение 10 минут при комнатной температуре.

Затем добавьте 2,5 миллилитра изоляционного буфера CD34 в каждый образец и поместите образцы в магнит на пять минут при комнатной температуре. Переверните магнит на пять секунд, чтобы слить изоляционный буфер. Повторив этот процесс четыре раза, снимите трубку с магнита и добавьте два миллилитра изоляционного буфера CD34.

После еще одного центрифугирования повторно суспендируйте гранулы CD34+клеток в одном миллилитре изоляционного буфера CD34 и подсчитайте клетки. Снова гранулируйте ячейки и повторно суспендируйте гранулу в 250 микролитрах буфера B и 250 микролитрах промывочного буфера. Далее тщательно повторно суспендируйте гранулы CD31 путем вортексирования пробирки, затем добавьте 20 микролитров гранул CD31 в повторно суспензированную клеточную гранулу и инкубируйте образец с покачиванием в течение 30 минут при комнатной температуре.

Перед отделением ячеек добавьте один миллилитр промывочного буфера, чтобы сбалансировать ситечко. Затем нанесите приготовленную смесь повторно суспендированных клеток в гранулах CD31 на ситечко. Промойте ситечко пятью миллилитрами буфера для стирки круговыми движениями на общий объем 20 миллилитров.

Присоедините коннектор к стерильной конической трубке объемом 50 миллилитров и закройте левритный замок. После присоединения фильтра к разъему добавьте один миллилитр буфера для промывки вдоль стенки фильтра, затем добавьте один миллилитр активированного буфера D вдоль стенки фильтра. Осторожно взболтайте образец и инкубируйте его в течение 10 минут при комнатной температуре.

Далее добавьте один миллилитр буфера для промывки и отделите ячейки от шариков пипетированием вверх и вниз 10 раз. Откройте левритный замок и дайте отделенным клеткам стечь в 50-миллилитровую коническую трубку. Каждый раз промойте ситечко 10 раз с одним миллилитром буфера для стирки.

Выбросьте соединитель и фильтр и центрифугируйте образцы при 300-кратном перегрузке в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Наконец, повторно суспендируйте клеточную гранулу в двух миллилитрах полной среды EGM2 для культивирования. Выращивайте клетки в шестилуночных планшетах, обработанных тканевыми культурами, с полной средой EGM2 в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом.

Заменяйте среду каждые три-четыре дня до тех пор, пока клетки не достигнут конфлюенции от 80 до 90%. Затем засейте примерно от 100 до 200 тысяч клеток в шестилуночные планшеты, обеспечив дубликаты лунок для каждого депо, и культивируйте их в полной среде EGM2 в течение двух дней. Через два дня отсасывайте от любой питательной среды.

Замените среду двумя миллилитрами среды DMEM/F-12 с 5% FBS и 50 микрограммами на миллилитр пенициллина стрептомицина для контрольных клеток. Для обработки клеток замените среду двумя миллилитрами среды для адипогенеза. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом в течение 13 дней, заменяя соответствующие среды каждые три-четыре дня.

Представлены репрезентативные результаты, показывающие типичную эндотелиальную булыжниковую морфологию CD34+CD31+клеток после двух пассажей в культуре. Также продемонстрирована способность клеток образовывать канальцы при культивировании в Матригеле, как и ожидалось. Равномерное поглощение флуоресцентно меченых ацетилированных ЛПНП свидетельствует о наличии однородной клеточной популяции с эндотелиальной идентичностью.

Показано окрашивание нейтральных липидных капель в CD34+CD31+ клетках Oil Red O после 13 дней адипогенной индукции. Показано, что репрезентативные ответы клеток сальниковых и подкожных депо трех разных субъектов человека иллюстрируют большую вариабельность реакции на адипогенную индукцию между жировыми депо одного и того же донора и между донорами. На этом изображении показано флуоресцентное внутриклеточное окрашивание липидов в CD34+C31+ клетках после адипогенной индукции в течение 13 дней.

На изображении показаны клетки с одногнездными липидами, многогнездными липидами и без накопления липидов. ПЦР в реальном времени показывает экспрессию пан-адипоцитарного маркера адипонектина и коричнево-бежевых маркеров CIDEA и UCP-1. Эти результаты подтверждают, что клетки, следующие за адипогенной индукцией, экспрессируют молекулярные маркеры, соответствующие смешанному фенотипу адипоцитов белого бежевого цвета.

После освоения этой техники ее можно выполнить за пять часов, если она выполнена правильно. При попытке проведения этой процедуры важно помнить об использовании свежей жировой ткани человека, которая была собрана и хранилась не дольше двух часов. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как проточная цитометрия, иммуногистохимия и ОТ-ПЦР для идентификации специфических подмножеств реагирующих клеток и экспрессии зрелых маркеров адипоцитов, которые могут быть использованы для идентификации бежевого коричневого фенотипа адипоцитов.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области ожирения к изучению роли жировой ткани, сосудистых клеток и адипогенеза у человека. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделять, культивировать и увеличивать CD34+31+клетки. Не забывайте, что работа с человеческими тканями может быть крайне опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как правила биобезопасности.

Применение этого метода распространяется на терапию сопутствующих заболеваний, связанных с ожирением, таких как резистентность к инсулину, поскольку он определяет адипогенный ответ клеток на потенциальное терапевтическое вмешательство.