Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans

Мы описываем изменение мелкомасштабной добычи и колориметрические анализов лактата и пирувата в нематода C. elegans. При использовании коммерческих пробирного наборы, техническое развитие их чувствительность и точность имеет важное значение. Осадков белок в добыче является наиболее важным этапом для количественного определения внутриклеточных метаболитов.

Это исследование может помочь ответить на любые вопросы в них биохимии кол и методологии области, такие как анализ прав на разработку в нематод. Основным преимуществом этой техники является белковые осадки в экстрадукции и питье и гомогенизации червей. Начните этот эксперимент с выращивания штамма E.coli OP50 в 300 миллилитров жидкой среды бульона LB при 37 градусах Цельсия за одну ночь.

Храните успешный OP50 при четырех градусах цельсия. Pipette два миллилитров культурных OP50 как минимум на трех ранее подготовленных NGM, или Nematode Рост Сми Агар плиты и распространение вручную закрученного пластины. Инкубировать пластины при комнатной температуре на ночь, чтобы создать тонкий слой OP50.

Затем используйте стерильную зубочистку, чтобы выбрать кусок агара из тарелки с червями, чтобы добавить не менее 100 червей к каждой пластине OP50 NGM. Культура по крайней мере три пластины с червями при 20 градусов по Цельсию, пока черви не достигнут стадии взрослого, что подтверждается под стереоскопическим микроскопом. Найдите гравидные гермафродиты, наполненные яйцами, с помощью стереоскопического микроскопа.

После добавления пяти миллилитров S-буфера к пластинам, используйте Пастер пипетку для передачи червей из всех трех пластин в 15 миллилитров конической трубки. Вымойте червей три раза, добавив 15 миллилитров S-буфера, а затем центрифугирования при 300 раз G при комнатной температуре в течение 30 секунд. Если объем S-буфера превышает пять миллилитров, удалите избыточный буфер после центрифугирования.

Для успешной экзонизации и массовой изоляции яйцеклеток растворите червей в 0,5 миллилитров щелочного раствора хлората гипо. Смешайте путем инвертирования и инкубации при комнатной температуре в течение 10 до 15 минут. Центрифуга при 1400 об/мин в течение 30 секунд, чтобы удалить раствор.

Используйте 15 миллилитров S-буфера для мытья яичных гранул. После центрифугирования его удалить супернатант и повторить эту стирку по крайней мере три раза. После последней стирки, мы приостанавливаем гранулы в пять-шесть миллилитров S-буфера, без E.coli и инкубировать яйца на ночь при 20 градусах по Цельсию, чтобы вылупиться из них и достичь H синхронной культуры личинок стадии L1.

Pipette 10 микролитров S-буфера, содержащего червей L1 на трех крышках скользит. Подсчитайте личинки под стереоскопическим микроскопом и вычислите среднее значение, чтобы определить приблизительное количество личинок стадии L1. Наконец, перенесите личинки стадии L1 на пять NGM Agar Plates с OP50 и выращивайте их при 20 градусах Цельсия до стадии молодого взрослого, во время которой происходит самоудобрение и откладываются несколько яиц.

Наблюдайте за червями каждый день под микроскопом, а затем собирать молодых взрослых, или пятидневных червей. Чтобы выбрать только живых червей, добавить червей приостановлено в три-четыре миллилитров S-буфера в 15 миллилитров конической трубки. Затем добавьте равный объем ледяной 60% сахарозы и перемешайте.

Центрифуга трубки при 1500 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 15 секунд. Затем используйте пипетку Pasteur, чтобы осторожно переместить червей со стенки трубки, а затем удалить плавающих червей в свежую трубку. Заполните трубку S-буфером для мытья червей и центрифугой при 1500 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 30 секунд.

Снимите буфер и повторите стирку еще два раза. После третьего мытья, тщательно удалить supernatant, убедившись, что не удалить червей, и использовать 1000 микролитер пипетки отзыв для измерения влажного объема промывают червей. Для белковых осадков используйте пипетку Pasteur, чтобы добавить промытых червей к равному объему ледяной 10% трихлороакетической кислоты в гомогенизаторе, помещенном на лед.

Гомогенизировать с помощью 40 штрихов passel с вращением, до 1300 об /мин. Используйте ультразвуковой гомогенизатор с 20%-долгу цикла sonicate гомогената. Используйте пипетку Pasteur для переноса гомогената в 1,5 миллилитровую трубку, помещенную на лед.

После переноса гомогената в микро центрифугу трубки, центрифуга на 8000 времени G при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы прояснить его. Перенесите супернатант в свежую трубку и добавьте четыре хлорида толярного калия и инкубировать на льду в течение 20 минут, чтобы нейтрализовать его. Затем центрифуга его на 8000 раз G при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут.

Перенесите супернатант в свежую трубку и храните при 80 градусах цельсия до тех пор, пока это не будет необходимо для дальнейших анализов. Для измерения концентрации лактата используйте набор колоритных анализов для проведения дубликатов анализов для тестовых образцов. Добавьте 10 микролитров тестовых образцов к каждому колодец пластины из 96 колодец, а затем добавьте лактатный буфер анализа к каждому образцу, чтобы настроить громкость до 15 микролитров.

Разбавить 100-миллиметровый стандарт L-Lactate с лактатным буфером анализа до одного миллимолара. Затем, в ряд скважин, добавьте ноль, два, четыре, шесть, восемь и 10 микролитров разбавленного стандарта L'Lactate. Добавьте 50 микролитров реакционной смеси к каждой хорошо, и инкубировать при комнатной температуре защищены от света, по крайней мере 30 минут для цвета развиваться.

Наконец, используйте считыватель микропластиц для измерения абсорбтности каждой пластины на 570 нанометров. Вычесть абсорбт фонового контроля смеси из поглощения реакции смеси. Затем вы график лактат стандартной кривой, и вычислить концентрации лактата из кривой путем умножения каждой концентрации на 2,25.

Используйте набор колоритетрического анализа для измерения концентрации пирувата в пробах испытаний и проведения дуплексных экспертиз. Добавьте 10 микролитров тестовых образцов в различные скважины пластины из 96 скважин и добавьте в каждый образец 90 микролитров работающего реагента. Инкубация покрывается в течение 30 минут при комнатной температуре.

Затем поместите пластину в считыватель микропластиц для измерения абсорбции каждой пластины на 570 нанометров. Участок пируват стандартной кривой, и вычислить концентрации пирувата из стандартной кривой путем умножения каждой концентрации на 2,25. И, наконец, для измерения концентрации белка в тестовых образцах используйте набор колоритных анализов, как описано в текстовом протоколе.

После белковых осадков, колоритные анализы могут быть использованы для количественного определения концентраций лактата и пирувата. Этот эксперимент показывает точность колоритных анализов, противоречащих предыдущим отчетам C.Elegans. Кроме того, эти анализы достаточно чувствительны для измерения концентраций лактата и пирувата даже в небольших пробах в течение короткого периода времени.

Для точного обнаружения лактата и пирувата в C.elegans, очень важно выполнять белковые осадки во время гомогенизации червей. Количество обнаруженного лактата и пирувата выше, когда образцы являются белками, осаждаемыми во время гомогенизации, по сравнению с нетронутой цитозоловой фракцией или после гомогенизации, когда не было обнаружено лактата или пирувата вообще.