Смешанных объемные сетчатки, Imaging наклонный офтальмоскопия лазерного сканирования (Осло) и оптическая когерентная томография (Окт)

Здесь мы представляем протокол получить большое поле зрения (FOV) трехмерной (3D) флуоресценции и OCT сетчатки изображения с помощью Роман изображений Мультимодальная платформа. Мы будем вводить настройки системы, метод выравнивания и оперативные протоколы. В естественных условиях изображений будет продемонстрирована, и представитель результаты будут предоставлены.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области офтальмологии и визуализации сетчатки. Например, визуализация и количественная оценка нарушения гемато-сетчаточного барьера и капиллярных функций сетчатки. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет получить трехмерную многоконтрастную визуализацию сетчатки с большим полем зрения, используя косой сканирующий лазер в одном растровом сканировании.

Применение этого метода распространяется на диагностику диабетической ретинопатии и других преретинальных заболеваний. Потому что oSLO может получать высококонтрастные изображения микроциркуляторного русла сетчатки, вплоть до отдельных капилляров в 3D. Хотя этот метод может дать представление о визуализации сетчатки, он также может быть применен к другим системам визуализации с использованием обычных объективов.

Например, визуализация коры головного мозга мыши in vivo. Сверхконтинуумный лазерный источник используется в качестве системного лазерного источника для установки косой сканирующей лазерной офтальмоскопии или oSLO. Диапазон видимого света отделен от диапазона более высоких длин волн первым дихроичным зеркалом.

Световой спектр расширяется парой дисперсионных призм, после чего луч проходит через поляризационный светоделитель. Щель используется для выбора диапазона длин волн возбуждения. А отражающее зеркало отражает отфильтрованный луч обратно к паре призм, чтобы связать свет в одномодовое волокно.

Спектрометр используется для подтверждения выбора длины волны на выходе одномодового волокна. Одномодовое волокно подключено к двум каскадным оптоволоконным соединителям. Один из выходных портов оптоволокна от второго оптоволоконного соединителя подает свет в систему oSLO.

Для коллимации лазера в системе oSLO лазер отклоняется зеркалом гальванометра. Система телескопов «один к одному» ретранслирует лазер на второе зеркало гальванометра, а система телескопов «три к одному» дополнительно ретранслирует лазер к зрачку глаза. Дихроичное зеркало в системе телескопов «три к одному» отражает флуоресцентные сигналы.

Система телескопов «три к одному» и дихроичное зеркало установлены на специальном ползунке типа «ласточкин хвост» для смещения оптической оси и создания косого сканирующего освещения. Косое освещение позволяет проводить объемную флуоресцентную визуализацию без необходимости секционирования. При смещении лазера косой луч фокусируется на сетчатке, а затем обнаружение косого излучения может захватывать томографическое флуоресцентное изображение вдоль траектории косого луча.

Для создания оптического пути флуоресцентного изображения флуоресценция отражается дихроичным зеркалом и передается на третье зеркало гальванометра. Затем флуоресцентный свет передается на линзу объектива изображения с помощью другой системы телескопов «один к одному». Под третьим зеркалом гальванометра установлены два дополнительных каскада трансляции для обеспечения резервирования степеней свободы для оптимизации изображения.

Окончательная система визуализации установлена на сцене, которая имеет три степени свободы. Вращение и две оси перемещения. Планарная камера используется для захвата изображений поперечного флуоресценции.

Еще одно дихроичное зеркало отделяет задний инфракрасный диапазон от остального света. Фильтр длинных частот используется для дальнейшего ограничения полосы пропускания до 800-900 нанометров. Соедините луч в одномодовое волокно.

Одномодовое волокно подключается к другому входному порту двух каскадных оптоволоконных соединителей для объединения с возбуждением синего oSLO. Свет со второго выходного порта второго оптоволоконного соединителя направляется на опорное плечо OCT. Который имеет пластины компенсации дисперсии, фильтр переменной нейтральной плотности и отражающее зеркало.

Свет, отраженный от эталонного плеча и глаза, рекомбинируется на втором оптоволоконном соединителе и подается на ОКТ-спектрометр для сбора сигнала. Используйте программное обеспечение системы сбора данных, написанное в Labview и модифицированное на основе сканирующего протокола сканирования OCTA. Для каждого b-скана аналоговая выходная плата выводит пилу с рабочим циклом 80% и 500 шагами для управления быстрым сканирующим зеркалом x-prime.

Запускайте камеру линейного сканирования на каждом шаге для получения данных для ОКТ, только когда зеркало находится в направлении прямой развертки. Установите время экспозиции для камеры линейного сканирования равным 17 микросекундам. Чтобы получить сигнал OCTA, повторите измерение пять раз в одном и том же месте b-скана.

Установите выходную частоту АО на 100 килогерц, а скорость ОКТ-линии A на 50 килогерц. Управляйте медленным сканирующим зеркалом с y-праймом, GM1, с помощью нарастающей формы волны. Синхронизируйте зеркало сканирования GM3 с GM1 для десканирования медленного сканирования.

Активируйте планарную камеру с помощью другой аналоговой выходной платы, чтобы получить одно флуоресцентное изображение в каждой точке y-prime. Обрежьте размер изображения или сгруппируйте соседние пиксели, чтобы увеличить скорость и чувствительность по мере необходимости. Начните с подтверждения соответствующего уровня анестезии у крысы отсутствием рефлекса отмены во время внутрипальцевого щипка.

После индукции анестезии поместите крысу на держатель. Установите носовой конус, чтобы сохранить анестезию в течение оставшейся части эксперимента. Нанесите 5 офтальмологических растворов тетракаина гидрохлорида на глаз крысы для местной анестезии.

Затем расширьте зрачок 1%-ным офтальмологическим раствором тропикамид. После двух минут расширения с помощью одномиллилилитрового шприца и иглы 29-го калибра введите через хвостовую вену 10% флуоресцеина или 10% FITC, разведенного в физрастворе. Затем включите источник лазера и установите фильтр нейтральной плотности, чтобы ослабить возбуждение синего света во время юстировки.

Измерьте мощность синего света, убедившись, что она меньше 10 микроватт. Затем переключитесь на оптический свет когерентной томографии, убедившись, что он близок к 8 милливатт. Включите подачу питания на зеркало гальванометра, которое используется для управления направлением лазера.

Отрегулируйте высоту глазного яблока, чтобы сделать неподвижное лазерное пятно на роговице. Отрегулируйте положение глаз так, чтобы край зрачка был примерно перпендикулярен лазеру. И смещение лазера примерно на 1,5 миллиметра от апикального центра глаза.

Далее отрегулируйте держатель животного до тех пор, пока изображения оптической когерентной томографии не достигнут оптимального качества. В направлении быстрого сканирования x-prime убедитесь, что изображение поперечного сечения b-скана выглядит плоским. При переключении на медленное направление сканирования y-prime убедитесь, что изображение b-скана в поперечном сечении выглядит наклоненным из-за наклонного сканирования.

Снимите фильтр нейтральной плотности до уровня возбуждения синего света. И следите за потоком с камеры в режиме реального времени. Должно появиться флуоресцентное изображение поперечного сечения, показывающее кровеносные сосуды на разной глубине.

Отрегулируйте фокус окончательной системы флуоресцентной визуализации для достижения оптимального фокуса. И выполнять тонкую регулировку положения глаз в боковой плоскости для достижения оптимального качества изображения косой сканирующей лазерной офтальмоскопии. После выравнивания начинают приобретать одновременную оптическую когерентную томографию ангиографию и волюметрическую флуоресцентную ангиографию.

На этом изображении показано изображение сетчатки крысы, полученное методом оптической когерентной томографии. Это оптическая когерентная томографическая ангиография, или ОКТА-изображение, той же области. А также косая сканирующая лазерная офтальмоскопия и объемная флуоресцентная ангиография с изображением поперечного сечения флуоресцентной ангиографии, или oSLO-VFA.

Аналогичен оптической когерентной томографии b-скан. По сравнению с ОКТА, косая сканирующая лазерная офтальмоскопия и изображение поперечного сечения объемной флуоресцентной ангиографии четко идентифицируют капилляры в наружном плексиформном слое. Поверхностный слой сетчатки показан здесь на изображении OCTA.

На изображении видны артефакты в виде вертикальных полос. oSLO-VFA избегает артефактов движения, используя контраст флуоресцентного излучения. В пределах промежуточного слоя сетчатки вертикально ныряющие суда четко видны на изображении oSLO FA.

Но не проявляется в OCTA. При попытке этой процедуры важно избегать непрерывного лазерного воздействия на глаза в течение более двух минут. Избегайте пересыхания роговицы и дайте глазу отдохнуть не менее 30 секунд между участками изображения, блокируя свет.

После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как визуализация генетически модифицированных мышей для экспрессии флуоресцентных белков, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Например, как могут изменяться определенные типы клеток сетчатки, и как вытягиваются прошлые наблюдаемые переменные с известными заболеваниями.