Роман насыщения мутагенеза подхода: Один шаг характеристика регламентационный протеин привязки сайтов в РНК с помощью кислота

Общая цель этого подхода к фосфоротиатам в РНК состоит в том, чтобы выполнить насыщенный мутагенез за один этап. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области молекулярной биологии, такие как регуляция генов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что за один шаг можно осуществить насыщенный мутагенез сайта связывания белка в РНК.

Ключевым этапом в этом одноступенчатом протоколе насыщенного мутагенеза является легирование матрицы ДНК нуклеотидами недикого типа внутри сайта связывания белка. Сначала синтезируйте праймер Т7 путем химического синтеза на синтезаторе ДНК. Далее синтезируют легированный олигонуклеотид, соответствующий сайту связывания белка.

В данном примере подчеркнутая последовательность содержит обратный комплемент сайта связывания белка дрозофилы, летального для пола, причем каждый сайт легирования представлен буквой X. Используйте соотношение 90% нуклеотида дикого типа к 10% нуклеотида недикого типа для каждого сайта легирования. Последовательность, выделенная зеленым цветом, комплементарна последовательности праймера Т7 и является промотором Т7 для транскрипции in vitro. Следующим шагом в этом протоколе является синтез отдельных РНК с каждым фосфоротиоатным нуклеотидом с последующим радиоактивным мечением РНК на 5-прайм-конце.

Синтезируйте РНК для каждого фосфоротиоата в реакции транскрипции объемом 20 микролитров. В каждую микроцентрифужную пробирку добавьте следующее:Т7 транскрипционный буфер, один микромоляр Т7 олигонуклеотид, один микромоляр легированный олигонуклеотид, 10 миллимоляр DTT, два миллимоляра GTP, по одному миллимоляру АТФ, CTP и UTP и две единицы на микролитр T7 РНК-полимеразы. Добавьте 0,167 миллимоляра альфа-тио АТФ в одну пробирку и 0,05 миллимоляра альфа-тио UTP в другую пробирку.

Инкубируйте реакционные смеси синтеза РНК при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Через два часа добавьте 2,5 микролитра термолабильной альфа-фосфатазы и 2,5 микролитра 10-кратного буфера фосфатазы в каждый образец РНК. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10-30 минут, чтобы удалить 5-первичные фосфаты.

Инактивируйте фермент щелочную фосфатазу путем нагревания при температуре 80 градусов Цельсия в течение двух-пяти минут. Остальные шаги связаны с использованием радиоактивности и должны быть выполнены с использованием соответствующих мер предосторожности и плексигласового экрана для защиты от радиоактивности. Для радиоактивного мечения 5-прайм-конца дефосфорилированной РНК используйте один микролитр полинуклеотидкиназы Т4 и один микролитр АТФ Gamma P32 в реакционном объеме 10 микролитров.

Инкубируйте реакционные смеси при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-60 минут. Инактивируйте фермент полинуклеотидкиназу Т4 путем нагревания при температуре 65 градусов Цельсия в течение 20–30 минут. Запустите реакции в 10% денатурирующем полиакриламидном геле.

Найдите РНК на геле с помощью авторадиографии и вырежьте срез геля, содержащий радиоактивно меченую РНК. Измельчите срез геля в микроцентрифужной пробирке, прижав его к стене наконечником пипетки, а затем добавьте буфер протеиназы К. Вращайте трубки при комнатной температуре от двух часов до ночи.

Затем центрифугируйте гелевую суспензию, соберите буферный раствор и выбросьте гель. Экстрагируйте каждый раствор дважды равным объемом фенолхлороформа. После этого извлеките раствор один раз с хлороформом.

Соберите водную фазу и добавьте к ней 0,1 объема трехмолярного ацетата натрия pH 5,2, носителя тРНК или гликогена, и 2,5 объема этанола. Держите образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение одного часа. Центрифугируйте образцы в высокоскоростной микроцентрифуге при 16,873 g в течение 5-10 минут.

Осторожно удалите буферный раствор этанола, не повреждая гранулы РНК. Промойте гранулы с 70% этанолом и центрифугируйте в течение двух-пяти минут. Осторожно удалите этанол и высушите гранулы на воздухе.

Повторно суспендируйте каждую гранулу в 20-50 микролитрах воды, обработанной DEPC. Хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия до использования. Концепция разделения из-за интерференции проиллюстрирована здесь.

В процессе связывания белка молекулы РНК разделяются между связанной с белком фракцией и несвязанной фракцией. Если конкретный нуклеотид в заданном положении препятствует связыванию с белком, он будет преимущественно исключен из фракции, связанной с белком. Впоследствии йод используется для расщепления РНК в местах включения фосфоротиоата.

Чтобы начать эту процедуру, настройте реакции связывания белка с РНК, каждая из которых содержит 10 миллимолярных Tris-HCl, один миллимолярный DTT, 50 миллимолярных хлоридов калия, 0,5 единицы на микролитр ингибитора РНКазы, 0,09 микрограмма на микролитр ацетилированного бычьего сывороточного альбумина, один миллимолярный ЭДТА, 0,15 микрограмма на микролитр тРНК, 5-прайм-энд радиоактивно меченой РНК и шесть микролитров соответствующей концентрации белка. Инкубируйте реакции, связывающие белки, при температуре 25 градусов Цельсия в течение 20–30 минут. Отделите связанную с белком фракцию РНК от несвязанной фракции путем связывания нитроцеллюлозного фильтра.

Нанесите реакцию связывания на нитроцеллюлозный фильтр, подключенный к вакуумному коллектору при комнатной температуре. Только белковый комплекс РНК будет удерживаться на фильтре, в то время как несвязанная РНК проходит через фильтр. Разрежьте часть нитроцеллюлозного фильтра, содержащую оставшуюся радиоактивную РНК, на более мелкие кусочки, чтобы они поместились в микроцентрифужную пробирку, и добавьте достаточное количество буфера протеиназы К, чтобы погрузить кусочки фильтра.

Вымывайте РНК из фильтрующих частиц на два-три часа или на ночь. Затем переложите раствор из каждой пробирки в новую пробирку и извлеките фенолхлороформом и хлороформом, как было показано ранее. Соберите водную фазу и добавьте к ней 0,1 объема трехмолярного ацетата натрия pH 5,2 и 2,5 объема этанола и выдержите в морозильной камере.

После центрифугирования, промывки и сушки РНК, как показано ранее, ресуспендируйте РНК в воде, обработанной DEPC. Все действия, связанные с йодом, должны выполняться в вытяжном колпаке. Чтобы расщепить РНК в местах встраивания фосфоротиоата, добавьте к каждому образцу РНК один миллимолярный йод в 20 микролитрах воды, обработанной DEPC, содержащей до 10 микрограммов тРНК-носителей.

Выдерживать при комнатной температуре в течение пяти минут. Осаждение расщепленной РНК путем добавления ацетата натрия и этанола, как показано ранее. Ресуспендируйте расщепленную РНК в загрузочном красителе для денатурирующих гелей.

После нагревания загрузите образцы в 15-20% денатурирующий полиакриламидный гель и отделите фрагменты РНК с помощью электрофореза. Подвергните полиакриламидный гель рентгеновской пленке и определите полосы в зависимости от общего пула в зависимости от общего пула с помощью авторадиографии. На этой схеме показана концепция разбиения из-за интерференции.

В полосе Т, общей фракции РНК, интенсивность полосы примерно одинакова для всех легированных позиций. В фракции связанной с белком РНК в положениях 1, 4 и 7 нуклеотид не оказывает влияния на связывание. Однако в положениях 3 и 6 он препятствует связыванию и исключается из связанной дроби.

В положении 5 помехи являются частичными. Сравнение парных дорожек для каждого нуклеотида позволяет анализировать все четыре нуклеотида. На этой авторентгенограмме видны две пары полос из денатурирующего геля.

Полоса T — это общая РНК, а полоса B — связанная с белком РНК. Вертикальной линией отмечена место связывания со смертельным исходом. Для пары альфа-тиоалин полосы 1, 2, 3 и 5 присутствуют в общей фракции РНК, но отсутствуют или значительно уменьшены в связанной фракции РНК.

Для альфа-тиоулинной пары полосы 7 и 8 относительно менее интенсивны в связанной фракции. Остатки, которые преимущественно исключаются из связанной фракции, важны для связывания с белками. После того, как РНК синтезирована и мечена 5-прайм-эндом, этот метод может быть выполнен за 12 часов, если он выполнен правильно.

При проведении этой процедуры важно помнить, что важным фактором является надлежащий уровень включения фосфоротиоата и определение подходящей концентрации белка для связывания. После этой процедуры могут быть использованы другие методы, такие как соответствующие функциональные анализы или тесты in vivo, чтобы подтвердить результат подхода мутагенеза и понять биологическую значимость. Этот метод является альтернативой другим методам, которые либо более дороги, либо более трудоемки, либо и то, и другое.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проектировать и синтезировать мутантную библиотеку, выполнять реакции связывания, идентифицировать мутантные нуклеотиды в каждом пуле и количественно анализировать влияние нуклеотидов недикого типа в каждой тестируемой позиции. Не забывайте, что работа с полиакриламидом и радиоактивностью может быть опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток, надлежащей выхлопной системы и радиоактивных экранов.