Метод Set реплики: Высок объём подход к количественной мерой Caenorhabditis elegans продолжительность жизни

Были идентифицированы сотни генов, функция которых влияет на то, как организм стареет. Но многие из их отношений плохо изучены. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области старения.

А именно, каковы генетические взаимосвязи между генами gerA? Основным преимуществом данной методики является увеличение пропускной способности, количество генетических предпосылок, которые могут быть количественно измерены одновременно, увеличивается как минимум на порядок. Данные о продолжительности жизни, собранные с помощью этой процедуры, могут быть построены и проанализированы с помощью программного обеспечения, которое мы предоставляем в этой публикации.

В дополнение к получению информации о продолжительности жизни, этот метод также может быть применен к другим возрастным фенотипам, таким как стрессоустойчивость и изменения в плане здоровья. Для этой процедуры создайте новый штамп подбиблиотеки РНК-интерференции. Сначала аликвотируйте каждую лунку 96-луночного планшета, с 200 микролитрами LB с ампициллином, используя 12-канальный пипеттер.

Простерилизуйте 96-контактный репликатор пластин, последовательно погрузив контакты в 50% отбеливатель с последующей ультрачистой водой. Затем обмакните кончики в этанол, и тщательно разожгите кончики. Затем осторожно снимите крышку из клейкой фольги с замороженной 96-луночной библиотечной пластины глицеринового запаса и аккуратно, но твердо измельчите кончики репликатора стерилизованных пластин в лунки еще замороженных запасов глицерина.

Затем прививают культуры и герметизируют привитую пластину проницаемой мембраной. Дайте культурам вырасти за ночь на столе. На следующий день простерилизуйте планшетный репликатор и осторожно снимите пломбу с ночной культуры, а кончики контактов репликатора погрузите в нее.

Затем инокулируйте прямоугольную пластину ампициллина и тетрациклинового агара LB с помощью штифтов. Равномерно надавите и небольшими круговыми движениями перенесите бактерии, не позволяя пятнам стать слишком тесными. Затем инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день, на каждые 10 необходимых реплик планшетов, загрузите каждую лунку из 96-луночного планшета с глубокими лунками 1,5 миллилитра LB с ампициллином. Далее инокулируйте лунки культивируемыми бактериями. Затем запечатайте пластину дышащей мембраной, культивируйте ее в течение 20 часов с встряхиванием.

Контрольные скважины должны быть разбросаны по 96 скважинам таким образом, чтобы при разделении суббиблиотечной пластины на 96 лунок на группы по 24 лунки, каждая секция из 24 скважин имела по одному из контрольных скважин. На следующий день загрузите 120 микролитров аликвот культуры в 24-луночные планшеты с помощью шестилуночной многоканальной пипетки с регулируемым расстоянием между наконечниками. Затем высушите пластины, открытые в ламинарном колпаке, пока вся жидкость не впитается.

Не давайте им пересохнуть. Обязательно сохраняйте концентрацию внимания при аликвотировании жидких культур, чтобы убедиться, что правильная бактериальная культура помещена в надлежащую лунку в 24-луночном планшете. Эксперименты с набором реплик начинаются с набора независимых 24-луночных реплицированных планшетов, каждая из которых засеяна клонами РНК-интерференции одних и тех же бактерий.

Для экспериментов на продолжительность жизни от 15 до 20 животных L1 добавляют в каждую лунку пластины и дают им вырасти до стадии L4. На уровне L4 FUdR добавляется во все скважины по всей репликации. Позже в тот же день можно взять повторную пластину из сета и засчитать ее в качестве первого тайм-пойнта.

Чтобы увеличить продолжительность жизни, жидкость добавляется в отверстия пластины, чтобы вызвать движение животного. Животных, которые не начинают двигаться, осторожно подталкивают червячной киркой. Затем записывается общее количество животных и количество мертвых животных.

Пластина из первого наблюдения затем отбрасывается. В следующей точке времени наблюдения из набора берется еще одна репликационная пластина, которая забивается аналогичным образом. Это повторяется через определенный интервал подсчета очков.

Каждый раз с новой тарелкой из тиражного набора. Продолжайте набирать очки по набору тарелок, пока в живых не останется ни одного животного. Во-первых, синхронизируйте популяцию животных с тем же методом подготовки на основе отбеливателя, который используется для традиционного анализа продолжительности жизни.

Затем, используя пипетку с регулируемым расстоянием между шестью лунками и резервуар с реагентами, засейте от 15 до 20 животных L1 в каждую лунку подготовленных 24-луночных планшетов. Во время посева пластин периодически подмешивайте L1 животных в раствор для поддержания равномерного распределения. Теперь пусть животные разовьются до L4. Для этого протокола необходимо знать время разработки L4.

Периодически следите за развитием червей. Когда животные достигнут L4, добавьте 24 микролитра 50x FUdR в каждую лунку и верните пластины в инкубатор. Использование животных L4 имеет решающее значение.

Если гермафродиты достигнут репродуктивной зрелости до добавления FUdR, их потомство выживет и будет питаться пищей. И наоборот, слишком раннее добавление FUdR приводит к разрыву у животных. В желаемые моменты времени используйте одну реплику, чтобы оценить жизнеспособность.

Для этого необходимо залить скважину раствором М9. Перед подсчетом жизнеспособности каждый день прощупывайте все скважины, в которых нет пищи, которые кажутся загрязненными или содержат животных с морфологическими дефектами или дефектами развития. Для каждой скважины запишите общее количество животных в лунке и проверьте состояние неподвижных червей, осторожно коснувшись каждого из них по голове червячной киркой.

Подсчитав всех неподвижных мертвецов в тарелке, выбросьте тарелку. Для этой процедуры выращивают преображенные е. Кишечная палочка на ночь в ЛБ с ампициллином.

На следующий день сконцентрируйте бактерии путем центрифугирования при давлении 3000 G в течение 15-20 минут. Ресуспендируйте бактерии в 1/10 от начального объема. Затем нанесите 200 микролитров 10-кратной бактерии на шестисантиметровые пластины.

Подготовьте три или четыре пластины для каждого условия испытания и добавьте две дополнительные пластины на случай загрязнения. Сушите пластины в порции с ламинарным потоком, пока вся жидкость не впитается или не испарится. После высыхания пластины храните в пластиковой коробке в течение ночи при комнатной температуре, чтобы стимулировать выработку двухцепочечной РНК.

Затем храните пластины до двух недель при температуре четыре градуса Цельсия. Для животных соберите гравида, взрослых животных в М9. Вымойте их дважды с помощью M9. Повторяем вращение на аспирации. Затем повторно суспендируйте C.elegans в четырех миллилитрах M9 и добавьте два миллилитра раствора гипохлорита.

червей в течение трех минут, с периодическим, энергичным встряхиванием. Затем под рассекающим микроскопом ищите облако яиц. Если облако не видно, сделайте вихрь червей еще на 10–20 секунд.

Далее быстро промываем яйца с помощью М9, два раза, как и раньше. И ресуспендировать промытые яйца в трех миллилитрах М9. Затем переложите яйца в новую, 15-миллилитровую пробирку, инкубируйте пробирку при температуре 20 градусов Цельсия с мягким вращением и дайте эмбрионам вылупиться на ночь. На следующий день определите плотность приготовленного раствора L1, рассчитав среднее количество L1s на микролитр в трех, 10-микролитровых каплях.

Загрузите подготовленные тарелки с бактериями по 50 L1 животных, каждая. Установите планшеты в инкубатор с температурой 20 градусов по Цельсию, пока эмбрионы не разовьются до стадии L4. Нормальное развитие от L1 до L4 занимает около 40 часов.

Затем, чтобы предотвратить производство потомства, добавьте 160 микролитров 50x FUdR в каждую тарелку. Затем удалите самцов, так как продолжительность жизни обычно измеряется только гермафродитами. После завершения переупакуйте пластины в инкубатор с температурой 20 градусов по Цельсию.

Пока все черви не умрут, ежедневно оценивайте их жизнеспособность. Для этого аккуратно коснитесь каждой неподвижной нематоды на голове платиновой проволокой или ресницей. Нереактивные животные мертвы, и их необходимо удалить из тарелки.

Обратите внимание на любые аномалии во время этой процедуры. Набор реплик и традиционные методы определения продолжительности жизни C.elegans дают аналогичные результаты с животными дикого типа N2. Например, нокдаун РНК-интерференции mml-1 или mxl-2 на основе кормления значительно снижал нормальную продолжительность жизни.

Это измерялось как с помощью традиционного анализа продолжительности жизни, так и с помощью анализа набора реплик. Также может быть обнаружено увеличение продолжительности жизни. На снимке показано, что РНК-интерференция для mdl-1 или mxl-1 значительно увеличивает продолжительность жизни C.Elegans при измерении по любой из методологий.

Используя метод набора реплик, можно одновременно количественно оценить изменения в продолжительности жизни по более чем 100 условиям, что было бы нецелесообразно при более традиционном подходе. Например, полногеномный скрининг РНК-интерференции на основе питания идентифицировал 159 генов, необходимых для увеличения продолжительности жизни, обеспечиваемого снижением daf-2 инсулиноподобной сигнализации. Связь между инсулиноподобной сигнализацией и этими генами была дополнительно описана путем измерения продолжительности здоровья животных.

О здоровье свидетельствовало взбивание c. Elegans при суспензии в растворе. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать РНК-интерференцию на основе кормления для измерения продолжительности жизни C.Elegans.

Но РНК-интерференция универсальна и может применяться для многих различных фенотипов. После освоения метод набора реплик позволяет оценивать продолжительность жизни более 100 клонов РНК-интерференции каждый день, если он выполнен правильно. Очки раннего и позднего времени могут быть набраны быстро.

Все животные в колодце будут либо живыми и движущимися, либо мертвыми. Подсчет очков занимает больше всего времени, когда животные начинают умирать. С учетом этого следует поэтапно организовывать независимые судебные процессы.