Белощекая балянусы improvisus как модель морской - выращивание и экспрессии генов

Культуральный комплекс может помочь ответить на ключевые вопросы в области экологии личинок, биообрастания и эволюционной биологии. В частности, он может быть использован в исследованиях рецептор-лигандных взаимодействий во время расселения личинок, разработке новых технологий защиты от обрастания, а также эволюции и функции генов, участвующих в осморегуляции. Основное преимущество этого модельного организма заключается в том, что усоногий ракушка Balanus improvisus устойчив, размножается круглый год и имеет относительно короткое время генерации.

Хотя этот метод может дать представление о выращивании усоногих ракушек, он также может быть применен к культивированию других морских организмов. Как правило, новички в этом методе будут испытывать трудности из-за большого количества деталей, которые важны для успеха, таких как снабжение хорошей морской водой, надежное производство высококачественного корма и постоянное внимание к очистке и кормлению культур. Демонстрировать процедуру будут Мартин Огемарк и Анна-Лиза Врэнж, техник и исследователь, работающий с ракушками.

Для начала установите рамки, которые смогут вместить несколько прозрачных термопластичных панелей. Просверлите два отверстия в верхних углах каждой панели и с помощью кабельных стяжек прикрепите панели к рамам. Чтобы собрать взрослых усоногих ракушек, разверните панели вертикально на глубине от одного до трех метров в спокойных водах.

Дав ракушкам осесть и вырасти до пяти миллиметров в диаметре, принесите панели в лабораторию. Затем расположите панели вертикально в подставке с фрезерованными пазами в полиэтиленовом лотке. Во-первых, используя нетоксичную, водостойкую ленту, склейте пять панелей вместе, чтобы создать куб, открытый сверху.

Поместите кубик в небольшой лоток и наполните его морской водой. Далее добавьте примерно 200 ципридов в верхней части кубика. Через день кормите молодых усоногих ракообразных 100 миллилитрами Skeletonema marinoi.

Через две-три недели на панелях куба должны прижиться молодые особи диаметром не менее пяти миллиметров. Разберите куб, и переместите панели в лотки с проточной морской водой. Чтобы собрать урожай науплии артемии, сначала выключите аэрационный насос и затемните бутылку, затем подсвечивайте нижнюю часть бутылки в течение 10 минут.

Вылупившиеся науплии артемий будут плыть к свету. Невылупившиеся цисты опустятся на дно, в то время как оболочки цисты всплывут наверх. Откройте зажим на дне и соберите промежуточную фракцию в виде плотной популяции плавающей науплии артемии.

Чтобы очистить панели со взрослыми ракушками, аккуратно опрыскайте их пресной водой и удалите загрязнения мягкой зубной щеткой. Очистите лотки без ракушек и трубки горячей пресной водой. Далее поместите сито в полиэтиленовый лоток с переливным отверстием.

Соберите личинки ракушек, которые оседают в сите на ночь. Затем наполните ведро 20 литрами отфильтрованной морской воды и одним литром смеси диатомовых водорослей, чтобы создать плотность 50 000 диатомовых водорослей на миллилитр. Переложите ранее собранные науплии ракушек в кристаллизующуюся посуду и подсвечивайте посуду сбоку.

Затем с помощью пипетки соберите науплии, которые плывут к свету, и переложите их в другую посуду. Переложите науплии в стакан, содержащий один литр отфильтрованной морской воды для подсчета. Далее добавьте один литр науплиусов в заранее подготовленное ведро.

Через три дня используйте 90-микрометровое сито, чтобы собрать науплии ракушек, затем очистите ведро, наполните его фильтрованной морской водой и добавьте новый корм для диатомовых водорослей и науплии ракушек. После еще двух-трех дней инкубации используйте сито 320 микрон поверх сита 160 микрометров, чтобы отделить нелинявшие науплии усоногих ракушек от ципридов. Установив четыре четырехлитровые бутылки для выращивания микроводорослей, поместите бутылки на свет с интенсивностью от 50 до 100 микромолей на квадратный метр.

Собирайте урожай, когда они станут достаточно плотными, чтобы их можно было использовать для подкормки. Во-первых, выберите крупных особей и воздержитесь от еды в течение двух дней до вскрытия. Затем очистите панцирь ракушки зубной щеткой и промойте водой, чтобы свести к минимуму загрязнение от других видов, присутствующих в окружающей среде.

Поместите отдельную ракушку на ровную поверхность для вскрытия, затем вставьте кончик пары щипцов между тергальной и щитковой пластинами. Возьмитесь за одну тарелку и осторожно потяните за нее, чтобы снять. Затем с помощью щипцов ухватитесь за перистую ракушку и вытяните ракушку наружу.

Наконец, поместите рассеченные ракушки непосредственно в 96% этанол или РНК-стабилизирующий раствор для фиксации. С помощью описанного здесь протокола за одну неделю может быть произведено до четырех партий личинок науплиуса усоногих ракушек. Максимум, каждая партия из системы культивирования состоит примерно из 12 000 науплиев, а это значит, что за неделю можно культивировать до 50 000 науплиев.

В течение недели от 70 до 90% собранных науплиусов превращаются в циприды, давая примерно 30 000 ципридов в неделю. В среднем 500 нанограммов высококачественной РНК было получено всего от 20 отдельных ципридов независимо от стадии заселения. У усоногих ракообразных 28S рРНК разрушается при нагревании.

Гомогенизация керамическими шариками обеспечивает высочайшую целостность РНК, что делает ее предпочтительным методом обработки тканей ракушек и членистоногих. С помощью анализа количественной ПЦР наблюдалось двукратное увеличение для длинных вариантов мРНК NAK1 и низкая соленость по сравнению с короткими NAK. Это указывает на то, что длинная форма преобладает в условиях низкой солености.

Требуется несколько недель обучения, чтобы освоить различные этапы, связанные с выращиванием ракушек. При выполнении этой процедуры особенно важно свести к минимуму загрязнение на всех этапах рабочего процесса культивирования. После своего развития этот метод культивирования сыграл важную роль в лучшем понимании экологии, физиологии и молекулярной биологии ракушек.

Он также является важным краеугольным камнем в превращении усоногого ракуса Balanus improvisus в мощную морскую модельную систему.