Bioprintable Альгинатные/желатин гидрогеля 3D в Vitro модель системы вызывать клетки сфероида образование

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии рака, такие как образование опухолей, отслеживание миграции клеток, а также передача сигналов рака и здоровых клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет изучать онкогенез в 3D-среде вместе со стромальными клетками, такими как фибробласты, с низкой стоимостью и высокой воспроизводимостью. Важно убедиться, что материалы являются как биопечатными, так и биофункциональными, что требует количественного изучения их реологических свойств и совместимости клеток.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы подготовки гидрогеля и смешивания гидрогеля в клетках трудно изучить, поскольку образование пузырьков влияет на точность напечатанной модели. В шкафу биобезопасности смешайте три грамма альгината и семь граммов желатинового порошка в стакане объемом 250 миллилитров. Добавьте магнитную мешалку и 100 миллилитров DPBS.

Заклейте стакан стерильной парафиновой пленкой и алюминиевой фольгой, чтобы избежать загрязнения. Затем покажите участнику уникальные и специфические полярные графики, которые соответствуют их электромиографическим или ЭМГ-паттернам. После этого продолжайте перемешивание при комнатной температуре в течение двух часов.

Нагрейте раствор до 37 градусов Цельсия до тех пор, пока гель не претерпит фазовый переход в жидкое состояние. Затем переложите раствор в стерильные 50-миллилитровые конические центрифужные пробирки, и закупорьте их. Центрифугируйте пробирки при 834 g в течение пяти минут, чтобы удалить пузырьки газа.

Далее аспирируйте гидрогелевый прекурсор в 10-миллилитровые шприцы. Запечатайте шприцы колпачками и парафиновой пленкой. Хранить при температуре четыре градуса Цельсия до готовности к использованию.

Когда вы будете готовы начать тестирование, поместите шприц с приготовленным гидрогелевым прекурсором в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на один час. Пока шприц нагревается, включите и инициализируйте реометр. Через час снимите шприц с водяной бани.

Выдавите примерно 0,5 миллилитра прекурсора на платформу реометра. На панели управления нажмите кнопку с треугольником вниз. Подождите, пока измерительный инструмент переместится вниз в положение обрезки.

С помощью шпателя обрежьте все излишки прекурсора, которые ускользнули от края измерительного инструмента, и выбросьте лишний материал. Затем нанесите пипеткой минеральное масло на край измерительного прибора. Подождите, пока масло полностью загерметизирует границу.

На панели управления нажмите «Продолжить». Затем нажмите кнопку «Пуск». После завершения тестирования отпустите измерительный инструмент и нажмите кнопку с треугольником вверх.

Снимите измерительный инструмент. Очистите измерительный инструмент и платформу 70% этанолом. Во-первых, выполните развертки по амплитуде и температуре, как указано в текстовом протоколе.

Чтобы начать изотермический временной анализ, щелкните Мои приложения и выберите шаблон для Изотермический тест времени-температуры. Щелкните шаг Измерение в рабочем процессе. Затем нажмите на переменную деформацию колебаний и откройте окно настройки.

Установите деформацию колебаний на 0,1% и установите частоту колебаний на один герц. В окне подтягивания установите количество точек данных равным 120. Установите частоту сбора данных равной одной точке в минуту.

Нажмите кнопку Добавить, чтобы добавить переменную температуры. Нажмите на переменную температуру и установите ее на 25 градусов по Цельсию. Щелкните правой кнопкой мыши шаг Устройство, Переместить к точке измерения в рабочем процессе.

Нажмите кнопку Удалить. Затем нажмите на шаг Устройство, Установить значение. Снимите флажок «Подождать, пока не будет достигнуто значение» и установите значение на 25 градусов по Цельсию.

Нажмите «Изображение», «Заголовок», «Кнопки» на нижнем экране. Снимите флажок «Продолжить». Затем нажмите на шаг «Начать», назовите проект и сохраните его.

Теперь загрузите образец на платформу реометра и начните тест в соответствии с ранее описанным общим протоколом тестирования. После этого наблюдайте за зависимостью G от простого числа и двойного простого G от времени. Найдите точку пересечения простого числа G и двойного простого числа G и определите время в точке пересечения.

Затем нажмите «Таблица», скопируйте все данные и вставьте их в текстовый файл. Чтобы измерить предел текучести при различных моментах гелеобразования, нажмите «Мои приложения». Нажмите на шаблон для параметра «Предел текучести и напряжение текучести, Гелеобразный».

Назовите этот проект. Далее нажмите на шаг «Начать» в рабочем процессе. В верхнем меню нажмите кнопку Вставить.

Затем в выпадающем меню выберите «Подождать». Откройте окно настройки и установите время ожидания на 50 минут. Нажмите «Пуск», затем снова нажмите «Вставить».

Выберите «Устройство» в раскрывающемся меню. Откройте окно настройки, выберите «Температура» и установите значение 25 градусов по Цельсию. Снимите флажок Ждать, пока будет достигнуто значение.

В рабочем процессе выберите шаг Измерение. Выберите переменную Напряжение сдвига и откройте окно настройки. Установите начальное и конечное напряжение сдвига равными нулю и 10 000 Паскаль соответственно.

Затем нажмите Калькулятор, установите Плотность точек на 0,2 пункта на паскаль. На вкладке Точки данных слева установите одну точку в секунду. В нижней части окна подтягивания выберите вкладку Контроль событий, установите критерий Остановить измерение, если скорость сдвига больше 100 в секунду.

Загрузите образец на платформу реометра и начните тест в соответствии с ранее описанным общим протоколом тестирования. После завершения испытания нажмите кнопку Диаграмма, чтобы посмотреть кривую деформации и напряжения. Повторите этот тест для времени ожидания 30, 40 и 50 минут.

Следующие действия должны быть выполнены в стерильных условиях. Для начала простерилизуйте биопринтер, тщательно распылив на него 70% этанола, а затем подвергнув воздействию ультрафиолетового света на ночь. Достаньте из хранилища шприц с прекурсором гидрогеля и прогрейте его на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа.

Перенесите Т-образную колбу с ранее культивированными клетками из CO2-инкубатора в шкаф биобезопасности. Выбросьте питательную среду, а затем дважды промойте клетки DPBS. Добавьте в клетки подогретый раствор трипсин-ЭДТА.

Выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести минут. После этого инактивируйте трипсин, добавив такой же объем FBS. Снимите шприц с гидрогелевым прекурсором с водяной бани, и очистите его.

Стерилизуйте шприц с 70% этанолом перед тем, как переместить его в шкаф биобезопасности. Выдавите примерно три миллилитра гидрогелевого прекурсора в 10-миллилитровый картридж. Смешайте прекурсор с клетками MDA-MB-231-GFP в концентрации один миллион клеток на миллилитр, медленно пипетируя его, чтобы избежать образования пузырьков.

Накройте картридж торцевой и верхней крышками, и заклейте его парафиновой пленкой. Затем центрифугируйте его при 834 g в течение одной минуты, чтобы удалить любые пузырьки газа. Повторите весь этот процесс для других предшественников.

После этого простерилизуйте все три картриджа с 70% этанолом. Загрузите стерилизованные картриджи в камеры биопринтера. В управляющем программном обеспечении принтера нажмите кнопку «Вручную».

Затем разверните вкладку «Инструментальная головка» в управляющем программном обеспечении принтера. Нажмите на один картридж в графическом интерфейсе слева, установите температуру картриджа на 25 градусов Цельсия и подождите 35 минут, чтобы предшественник достиг пригодных для печати условий. Повторите то же самое для двух других картриджей.

В управляющем программном обеспечении принтера разверните вкладку «Инструментальная головка». Нажмите на один картридж в графическом интерфейсе, затем нажмите короткую кнопку «Измерить», чтобы измерить положение наконечника сопла. Повторите то же самое для двух других картриджей.

Затем установите прозрачную микропластину из полистирола на столик принтера. Откройте файл G-кода и измените давление на 200 килопаскаль для всех картриджей. Вернитесь к управляющему программному обеспечению и перейдите на вкладку Генератор скафпапок.

Выберите точку для начала печати и нажмите кнопку «Выполнить». Повторите этот процесс, чтобы получить три реплики. После этого добавьте 100-миллимолярный раствор хлорида кальция на одну минуту для сшивания моделей.

Дважды промыть с помощью DPBS. Затем с помощью шпателя аккуратно переложите модели на покрытую агарозой шестилуночную пластину. Добавьте пять миллилитров DMEM в каждую лунку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, заменяя среду для культивирования клеток каждые три дня.

В этом исследовании трехмерные гидрогелевые системы были изготовлены для повторения in vivo опухолевого микроокружения и облегчения формирования многоклеточных опухолевых сфероидов. Температурный анализ предшественника A3G7 показывает, что двойное простое число G больше, чем простое число G при 37 градусах Цельсия, что подтверждает известные свойства предшественника. По мере снижения температуры предшественник подвергается физическому гелеобразованию из-за спонтанного физического запутывания молекул желатина в образование тройной спирали.

Как простое G, так и двойное простое число G увеличиваются, температура снижается и сходятся на 30,6 градусах Цельсия, что указывает на золь-гель переход. Конфокальная микроскопия напечатанной модели пропеллера показывает, что клетки MDA-MB-231-GFP начинают развивать сфероиды через 15 дней после начала периода культивирования, и сфероиды продолжают увеличиваться в размерах и количестве до 30-го дня. Некоторые из ячеек IMR-90-mCherry также образуют агломерации.

После 30 дней культивирования клетки IMR-90-mCherry можно было наблюдать в области, первоначально занимаемой клетками MDA-MB-231-GFP, в то время как клетки MDA-MB-231-GFP можно было наблюдать в области, где преобладал IMR-90-mCherry. Это подразумевает возможные события миграции в модели. Конфокальная микроскопия модели диска показывает, что клетки MDA-MB-231-GFP ведут себя аналогично тому, как они вели себя в модели пропеллера, в результате чего после 21 дня культивирования образуется гидрогель, насыщенный сфероидами.

Однаждыв освоение, эту технику для печати моделей можно сделать за два часа, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что гидрогель и клетки должны оставаться как можно более свежими, не смешивать старые партии гидрогеля с новыми и работать в стерильных условиях, чтобы избежать вводящих в заблуждение результатов. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как сканирующая электронная и покадровая микроскопия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как пористость материала, скорость миграции клеток и ремоделирование матрицы.

Применение этого метода распространяется и на терапию рака, поскольку эта модель in vitro позволяет систематически контролировать исследования образования опухолей и поведения в системах совместного культивирования. Помимо клеток рака молочной железы, модель также может быть легко применена к системам, использующим другие типы клеток в различных исходных местах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создавать 3D-модели гетерогенных заболеваний, правильно подготавливая гидрогели, встраивая в них клетки и печатая материал в оптимальном окне печати.

Не забывайте, что работа с биологическими образцами может быть чрезвычайно опасной, и во время выполнения этой процедуры необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты, таких как перчатки, лабораторный халат и защитные очки.