Комбинаторные одноклеточных подход к характеризуют молекулярных и иммунофенотипических неоднородность человеческих стволовых и прогениторных населения
25 октября 2018 г.
Основная ген выражение измерения облако отдельной ячейки различия в гетерогенных клеточных популяций. Здесь мы описываем протокол для анализа выражения гена как одноклеточных и индекс Сортировка по цветения активирован ячейку Сортировка (FACS) могут быть объединены для разграничения неоднородность и immunophenotypically характеризуют молекулярно различных клеточных популяций.
Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области стволовых клеток и рака, такие как то, что неоднородность стволовых клеток выглядит и как терапия в чувствительных раковых клеток могут быть изолированы. Основным преимуществом этого исследования является то, что он сочетает в себе технически надежный одноклеточный анализ экспрессии генов вместе с вакцинозом для дальнейшей характеристики целевых субпопуляций ниже по течению. Хотя этот метод может быть использован для исследования рака и неоднородности стволовых клеток, он также может дать представление о генном грунтовке и потенциале линии.
Чтобы начать протокол, на скамейке без РНК/ДНК, подготовить достаточно лиза буфер для 96 скважин с 10%extra путем смешивания 390 микролитров нуклеазы свободной воды, 17 микролитров 10%NP-40, 2,8 микролитров 10 миллимолярной dNTP, 10 микролитров 0,1 молар DTT, и 5,3 микролитров ингибитора РНК. Вихрь и спина вниз по трубке. Далее разпределим четыре микролитера буфера лиза в каждый колодец 96-колодец ПЦР пластины и запечатать пластины клейкой пленкой.
Спин вниз пластины для сбора жидкости в нижней части. Держите пластины на льду до сортировки клеток в течение максимум 24 часов. После того, как машина FACS была правильно настроена, выполните повторное исследование целевой популяции, сортирует по крайней мере 100 целевых ячеек в новую микроцентрифугную трубку со 100 микролитровами буфера пятен.
FACS анализирует отсортированные ячейки, записывая отсортированную пробу и убедитесь, что они находятся в воротах сортировки. Затем на настройку одноклеточной сортировки пластин, центрирование падение в хорошо A1 в 96-хорошо пластины. Когда он по центру, сортировать от 50 до 106 микрометров частиц во всех скважинах вокруг края пустой пластины 96 скважин, чтобы гарантировать, что все скважины получат ячейку в центре каждой скважины.
Снимите клейую пленку с пластин. Сортировать одну ячейку Lin-CD34 плюс CD38 минус клетки в 92 из 96 скважин. Активируйте сортировку индекса в программном обеспечении для сортировки FACS, чтобы сохранить иммунофенотипический профиль для CD45RA, CD49F и CD90 для каждой ячейки.
Сортировать две скважины с 10 и 20 ячейками соответственно для линейного управления в усилении ПЦР. Обычно используются скважины H1 и H2. Держите две скважины без каких-либо ячеек, как нет шаблона управления, как правило, скважины H3 и H4. Печать пластин с ясной клейкой пленкой и спина пластин в 300 раз тяжести в течение одной минуты.
Привязать заморозить пластины на сухом льду. Затем храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Сделайте обратную транскрипцию и конкретную целевую смесь усиления, добавив 632,5 микролитера двух времен смеси реакции, 101,2 микролитров Taq/SuperscriptIII, 151,8 микролитров грунтовки смеси и 0,7 микролитров шипами в контрольной РНК.
Вихрь раствора и спина его вниз, чтобы собрать жидкость в нижней части трубки. Держите смесь на льду, пока она не будет готова к добавлению в образец. Далее оттаивать лизные плиты на льду.
Добавьте 8,75 микролитров ранее подготовленной обратной транскрипции и конкретную целевую смесь усиления в 92 скважины, включая линейность и отсутствие элементов управления шаблонами. Добавьте 8,75 микролитров без обратной смеси транскрипции в четыре оставшиеся скважины. Затем запечатать пластины с ясной клейкой пленкой и спина пластин для сбора жидкости в нижней части.
Выполните обратную транскрипцию и конкретное целевое усиление, запуская пластину в машине PCR в соответствии с программой предусиливания. Подготовь анализ погрузочной пластины, засовывав три микролитера анализа, загружая реагент к каждой пластине из 96-х колодец. Добавьте три микролитров каждой грунтовки к отдельным скважинам в погрузочной пластине анализа.
Печать пластины с клейкой пленкой и спина его вниз. После вращения пластины, подготовить разбавленной пластины путем трубопроводов восемь микролитров нуклеазы свободной воды во все колодцы 96-хорошо пластины. Добавьте два микролитров усиленного образца к пластине разбавления.
Печать пластины с клейкой пленкой. Смешайте путем вихревого пластины в течение 10 секунд. Затем вращайся вниз по тарелке.
Далее подготовьте смесь погрузочной смеси образца, тщательно смешивая 352 микролитров мастер-микса с 35,2 микролитров образца погрузочного реагента. Подготовь образец погрузочной пластины путем алицитирования 3,3 микролитров погрузочной смеси к каждой пластине из 96-колодец. Добавьте 2,7 микролитров из разбавленного образца в каждую колодец погрузочной пластины образца.
Печать пластины с клейкой пленкой и спина его вниз. Вынюхив новый чип 96 на 96 микрофлюидных чипов. Подготовьте входы, тыкая их шприцем с крышкой, чтобы убедиться, что они могут быть перемещены.
Добавьте полный объем шприцев к каждому клапану, наклоняя чип до 45 градусов и прижимая к клапану. Премьер чип с контроллером IFC. Загрузите каждый вход анализа с 4,25 микролитров из каждой из скважин в анализе погрузочной пластины и избежать пузырьков.
Если пузырьки появляются в колодец, удалите их кончиком пипетки. Продолжить загрузку каждого образца вход с 4,25 микролитров из каждой из скважин в образце загрузки пластины, избегая пузырьков, и если пузырьки появляются удаления их с наконечником пипетки. Загрузите чип контроллером Integrated Fluidics Circuit или контроллером IFC.
Убедитесь, что чип выглядит даже и что все камеры были загружены. Удалите пыль с поверхности чипа, прикоснувшись к ней лентой. Наконец, запустите чип в мультиплексной платформе экспрессии микрофлюидных генов.
Тепловая карта успешного запуска отображает равномерно распределенное выражение между образцами с сильным сигналом от семи до 25 CTs. Эта кривая усиления шипами в управлении РНК проверяет, что все скважины имеют четкое выражение около 10 КТ практически без изменений, подтверждая, что предварительное усиление и qPCR реакции были успешными для всех клеток. Принцип компонентного анализа или PCA, который визуализирует сходство между группами клеток с помощью уменьшения размера, может быть полезен для различения кластеров молекулярно отличающихся клеток друг от друга здесь, идентифицяющих четыре подгруппы.
Чтобы определить иммунофенотип клеток из различных молекулярных кластеров, загрузите файл индекса FCS в FlowJo. Откройте редактор сценария и вставьте сценарий индекса, нажмите Run. Теперь каждая ячейка будет в отдельных воротах.
Добавьте каждую ячейку в редактор макета и раскрась их в соответствии с молекулярно-определенной группировкой из SCXV, доступной в файле sample_complete_data.xls. Участки FACS показывают выражение маркера поверхности клетки для гематопоэтических маркеров стволовых клеток CD90 и CD45RA, которые могут быть использованы для различеизации кластеров и их изоляции для функционального анализа. После этой процедуры, другой метод, как РНК секвенирования вновь обнаруженных субпопуляций или in vitro и in vivo эксперименты могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительный вопрос, как то, что молекулярный механизм вызывает эту неоднородность и как субпопуляция отличается функционально.
Эта стратегия проложила путь для исследователей, чтобы не только исследовать неоднородность в нормальных и злокачественных гематопоэз, но также может быть использован для потенциально изолировать обнаруженных субпопуляций для дальнейшего их изучения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол, сочетающий анализ экспрессии генов в отдельных клетках с сортировкой клеток с помощью флуоресцентно-активированного сепаратора (FACS) для изучения гетерогенности клеточных популяций. Целью работы является характеристика молекулярно различных типов клеток, в частности, в контексте стволовых клеток и рака.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Нейробиология
- Исследования рака
Теоретические основы
- Измерения экспрессии генов в общей массе клеток могут скрывать различия между отдельными клетками.
- Понимание гетерогенности стволовых клеток имеет решающее значение для прогресса в терапии.
- Метод FACS позволяет изолировать специфические популяции клеток для детального анализа.
- Данный метод дает представление о прайминге генов и потенциале развития клеточных линий.
Цель исследования
- Для определения гетерогенности клеточных популяций.
- Для иммунофенотипической характеристики различных типов клеток.
- Для исследования влияния терапии на чувствительные раковые клетки.
Используемые методы
- Приготовление лизирующего буфера для анализа единичных клеток.
- Использование флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS).
- Анализ экспрессии генов в единичных клетках.
- Последующая характеристика целевых субпопуляций.
Основные результаты
- Метод эффективно выявляет гетерогенность стволовых клеток.
- Он позволяет выделять специфические популяции раковых клеток.
- Были получены данные о прайминге генов и потенциале дифференцировки по клеточным линиям.
- Протокол технически надежен и воспроизводим.
Выводы
- Данный подход расширяет понимание клеточного разнообразия.
- Он имеет потенциал применения как в исследованиях стволовых клеток, так и в исследованиях рака.
- Комбинация этих методов обеспечивает комплексный анализ клеточных популяций.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Этот комбинаторный подход на уровне отдельных клеток устраняет критическое узкое место в исследованиях стволовых клеток и рака, сохраняя разрешение единичных клеток при молекулярном профилировании, что позволяет точно идентифицировать редкие субпопуляции, определяющие терапевтическую резистентность или дифференцировку линий. Связывая иммунофенотипические маркеры с профилями экспрессии генов с разрешением на уровне одной клетки, данный метод повышает достоверность валидации мишеней и способствует снижению механистических рисков на ранних этапах разработки. Этот подход обеспечивает масштабируемый и воспроизводимый рабочий процесс для получения количественных мультимодальных данных, которые служат основой для принятия решений о целесообразности дальнейших действий (go/no-go) при приоритизации мишеней и поиске ведущих соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы за счет разрешения молекулярной и иммунофенотипической гетерогенности популяций стволовых клеток и клеток-предшественников.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем корреляции экспрессии поверхностных маркеров с предварительно выбранными панелями генов, что снижает количество ложноположительных результатов при выборе мишени.
- Прогностическая ценность: облегчает идентификацию молекулярно различных субпопуляций для последующей изоляции, что повышает достоверность оценок потенциала дифференцировки и прайминга генов.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные количественные данные об экспрессии генов, связанные с индексной сортировкой FACS, что обеспечивает воспроизводимый скрининг молекулярных состояний в популяциях клеток.
- Масштабируемость: совместимость с 96-луночными форматами и микрофлюидными платформами обеспечивает возможность проведения среднепроизводительного скрининга заранее определенных панелей генов в первичных образцах человека.
- Воспроизводимость: техническая вариабельность минимизируется за счет лизиса одиночных клеток в буфере и этапов преамплификации, что гарантирует стабильное детектирование транскриптов с низкой экспрессией.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает возможность последующей изоляции молекулярно определенных субпопуляций для функциональной валидации in vitro и in vivo, связывая этап открытия с доклинической разработкой.
- Согласование биомаркеров: способствует идентификации сигнатур поверхностных маркеров, коррелирующих с молекулярными кластерами, что помогает в разработке трансляционных биомаркеров для стратификации пациентов.
- Прогресс с учетом рисков: предоставляет данные о механизмах гетерогенности, которые позволяют обоснованно выбирать доклинические модели и снижать биологические риски на поздних стадиях разработки терапевтических средств.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска путем обеспечения профилирования гетерогенных популяций с высоким разрешением до этапа идентификации соединений-лидеров, что особенно актуально для программ по регенеративной медицине и исследований раков, вызванных стволовыми клетками. Он превращает молекулярную и фенотипическую характеристику в непрерывную, многократно используемую возможность, а не в разовый анализ, что способствует итеративному уточнению мишеней.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению путей посредством связывания экспрессии генов в отдельных клетках с иммунофенотипическими профилями, что позволяет снизить биологические риски при выборе мишеней в гематологическом и онкогенном контекстах.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных данных из предварительно амплифицированной кДНК, готовых для анализа, что облегчает надежное сравнение молекулярных состояний различных отсортированных единичных клеток.
- Аналитика: позволяет проводить анализ главных компонентов (PCA) и визуализацию с помощью тепловых карт для идентификации молекулярных кластеров и их корреляции с экспрессией поверхностных маркеров для разграничения субпопуляций.
- Трансляционные исследования: связывает молекулярную кластеризацию с функциональной валидацией путем проспективной изоляции субпопуляций для последующего секвенирования РНК или анализов in vivo.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный протокол мультиплексного анализа единичных клеток, который может быть адаптирован для различных модельных систем и терапевтических областей, сокращая избыточную разработку методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования при валидации мишеней за счет устранения молекулярной гетерогенности, скрытой при групповом анализе.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированным рабочим процессам лизиса, преамплификации и qPCR, совместимым с существующей инфраструктурой FACS и микрофлюидики.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах выявлять функционально значимые субпопуляции, что снижает инвестиции в неперспективные мишени.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков, предоставляя механистическое обоснование для перевода молекулярно определенных популяций на стадию доклинической валидации.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с индексированным сортингом FACS, манипуляциями с единичными клетками и микрофлюидными платформами для qPCR.
- Зависит от доступа к сортировщикам клеток с флуоресцентной активацией, обладающим функцией индексированного сортинга, и к микрофлюидным системам анализа экспрессии генов.
- Необходимо обеспечить стандартизацию между исследовательскими группами в вопросах приготовления буфера для лизиса, стратегий установки гейтов при сортировке и алгоритмов анализа данных.
- Адаптация метода для негемопоэтических систем может потребовать оптимизации панелей поверхностных маркеров и условий лизиса.
- Практические ограничения включают лимиты пропускной способности, связанные со скоростью сортировки и загрузкой микрофлюидных чипов; метод лучше всего подходит для анализа ограниченных панелей, а не для скрининга всего транскриптома.
