Выражение и очистки от млекопитающих Bestrophin ионных каналов

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с биофизикой ионных каналов млекопитающих, включая, помимо прочего, семейство ионных каналов бестрофинов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть применена к другим типам ионных каналов и позволяет получать ключевые продукты для различных последующих анализов in vitro. Применение этого метода распространяется и на терапию бестрофинопатий, потому что анализы с использованием очищенного белка вносят свой вклад в наши знания о том, как работают бестрофиновые каналы в сетчатке и как мутации в гене BEST1 вызывают макулярную дегенерацию.

За двадцать четыре часа до вирусной инфекции добавьте равный объем трипанового синего к 15 микролитрам аликвоты HEK293F клеточной культуры и проверьте плотность и жизнеспособность клеток с помощью гемоцитометра под микроскопом. После проведения подсчета клеток поместите в каждую из двух одноразовых двухлитровых колб с 0,6 умножить на 10 до шестой части на миллилитр в объеме 500 миллилитров. Поместите колбы в увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 8% углекислого газа.

Вращайте культуру на орбитальной платформе со скоростью 135 об/мин. В день заражения проверьте плотность клеток и жизнеспособность 15 микролитров аликвоты культуры, как и раньше. Высокая жизнеспособность клеток более 95% имеет важное значение для эффективной инфекции и экспрессии белка.

Ожидаемая плотность клеток составляет примерно один умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр, а ожидаемое общее количество клеток составляет примерно 1 умножить на 10 к девяти. Добавьте в клетки бакуловирус Р3 при кратности инфекции пяти. Чтобы определить количество вируса, которое необходимо привить, используйте уравнение, показанное на экране.

Затем инкубируйте привитые клетки в течение 24 часов. Через двадцать четыре часа добавьте бутират натрия до конечной концентрации 10 миллимоляров в каждую клеточную культуру и верните в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия или 30 градусов Цельсия на 48 часов. Через сорок восемь часов проверьте процент и яркость зеленых клеток, которые непосредственно представляют белок под флуоресцентным микроскопом.

Соберите клетки путем центрифугирования при 1000 g при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточные гранулы фосфатно-солевым буфером до конечного объема примерно 80 миллилитров. Разделите каждую клеточную суспензию между двумя 50-миллилитровыми коническими пробирками и центрифугируйте в течение 20 минут при 1000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия.

Чтобы начать процедуру очистки белка, сначала разморозьте клеточные гранулы на водяной бане при перемешивающей комнатной температуре. Когда гранулы разморозятся через 10-15 минут, ресуспендируйте клетки в двойном объеме буфера А с добавлением ингибиторов протеиназы. Интенсивно пипетируйте вверх и вниз, чтобы получить однородную клеточную суспензию.

Лизируйте клетки с помощью гомогенизатора высокого давления. Пропустите клеточную суспензию через гомогенизатор со скоростью от семи до 10 мегапаскаль три-четыре раза, чтобы добиться полной гомогенизации. Держите лизат клеток на льду в течение двух-трех минут между раундами.

Добавьте в лизат клеток моющее средство. Инкубируйте с перемешиванием в течение часа при температуре 20 градусов Цельсия для извлечения мембранных белков. После инкубации лизат клеток центрифугирует в 150 000 раз больше g в ультрацентрифуге при четырех градусах Цельсия в течение одного часа.

После центрифугирования лизат прозрачных клеток будет зажат между гранулой внизу и мутным слоем сверху. Используйте переводную пипетку объемом 10 миллилитров, чтобы аккуратно собрать прозрачный лизат, а затем переключитесь на пипетку объемом один миллилитр для последних нескольких миллилитров лизата. Нанесите лизат на пятимиллилитровую колонку HisTrap nickel NTA affinity, предварительно уравновешенную буфером A. Затем промойте колонку 25 миллилитрами буфера B, а затем 40 миллилитрами буфера C. Здесь протокол можно приостановить.

Белок будет оставаться стабильным при прикреплении к колонке на ночь. После промывки присоедините колонку к системе быстрой жидкостной хроматографии с быстрым белком и разведите белок из колонки 13 миллилитрами буфера D с фракционированием. Соберите обогащенные белком фракции в соответствии с показаниями УФ-поглощения.

Измерьте концентрацию элюированного белкового продукта на микрообъемном спектрофотометре путем измерения поглощения на 280 нанометрах. Чтобы удалить метку GFP10x, добавьте протеазу TEV в соотношении массы один к одному и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. Сконцентрируйте белок в конечный объем от 400 до 500 микролитров с помощью центробежного фильтра объемом 15 миллилитров путем вращения со скоростью 4000 г в центрифуге с температурой 4 градуса Цельсия с переменными интервалами, начиная с 10 минут.

Перелейте концентрированный белок в чистую пробирку объемом 1,5 миллилитра и удалите все осадки или пузырьки из концентрированного продукта. Вращайте при 12 000 умноженных на g в течение пяти-10 минут при четырех градусах Цельсия, затем перенесите надосадочную жидкость в новую 1,5-миллилитровую трубку. Используйте одномиллилитровый шприц и иглу с круглым наконечником для загрузки конечного продукта в систему FPLC для эксклюзионной хроматографии с колонкой исключения размера, предварительно уравновешенной буфером E. Хорошо ведущие себя белки работают как один пик.

Соберите белковую фракцию или несколько фракций, которые соответствуют этому пику. Сконцентрируйте белок с помощью центробежной фильтрующей установки объемом четыре миллилитра или 0,5 миллилитра с той же молекулярной массой, что и ранее. Вращайте со скоростью 4000 раз больше g при четырех градусах Цельсия до конечной концентрации от пяти до 10 микрограммов на микролитр.

С помощью спектрофотометра проверьте концентрацию конечного продукта. Наблюдаемая здесь интенсивность флуоресценции в временно трансфицированных адгезивных клетках HEK293 является хорошим индикатором прогнозируемого уровня экспрессии белка в взвешенных HEK293F клетках, показанных здесь. Об успешной очистке свидетельствует один главный пик в ожидаемом объеме разведения в эксклюзионной хроматографии размера и одна доминирующая полоса на денатурированном геле страницы SDS.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что во время очистки все должно быть на льду, а если вы выполняете несколько очисток одновременно, часто меняйте перчатки и следите за тем, чтобы не загрязнить образцы. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как рентгеновская кристаллография и анализ липидных бислоев, чтобы ответить на такие важные вопросы, как взаимосвязи между структурой и функциями. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области наследственных заболеваний сетчатки к изучению причин бестрофинопатий на молекулярном уровне.